Kroniske sår, der er resistente over for antibiotika, er en stor trussel mod sundhedssystemet. Biofilminfektioner er stædige og fjendtlige og kan forårsage mangelfuld funktionel sårlukning. Vi rapporterer en klinisk relevant svinemodel af biofilminficerede kroniske sår i fuld tykkelse. Denne model er kraftfuld til mekanistiske undersøgelser såvel som til test af interventioner.
Biofilminfektion er en stor bidragyder til sårkronicitet. Etablering af klinisk relevant eksperimentel sårbiofilminfektion kræver involvering af værtsimmunsystemet. Iterative ændringer i værten og patogenet under dannelsen af en sådan klinisk relevant biofilm kan kun forekomme in vivo. Svinesårmodellen er anerkendt for sine fordele som en kraftfuld præklinisk model. Der er flere rapporterede tilgange til undersøgelse af sårbiofilm. In vitro – og ex vivo-systemer er mangelfulde med hensyn til værtens immunrespons. Kortvarige in vivo-undersøgelser involverer akut respons og tillader derfor ikke modning af biofilm, som det vides at forekomme klinisk. Den første langsigtede svinesår biofilm undersøgelse blev rapporteret i 2014. Undersøgelsen anerkendte, at biofilminficerede sår kan lukke som bestemt af planimetry, men hudbarrierefunktionen på det berørte sted kan muligvis ikke genoprettes. Senere blev denne observation valideret klinisk. Begrebet funktionel sårlukning blev således født. Sår, der er lukkede, men mangelfulde i hudens barrierefunktion, kan betragtes som usynlige sår. I dette arbejde søger vi at rapportere de metodologiske detaljer, der er nødvendige for at reproducere den langsigtede svinemodel af biofilminficeret alvorlig forbrændingsskade, som er klinisk relevant og har translationel værdi. Denne protokol giver detaljeret vejledning om etablering af en 8 ugers sårbiofilminfektion ved hjælp af P. aeruginosa (PA01). Otte brændesår i fuld tykkelse blev skabt symmetrisk på dorsum af tamme hvide grise, som blev podet med (PA01) på dag 3 efter forbrænding; efterfølgende blev ikke-invasive vurderinger af sårhelingen udført på forskellige tidspunkter ved hjælp af laser speckle imaging (LSI), ultralyd med høj opløsning (HUSD) og transepidermalt vandtab (TEWL). De podede brandsår blev dækket af en firelags dressing. Biofilm, som etableret og bekræftet strukturelt af SEM på dag 7 efter podning, kompromitterede den funktionelle sårlukning. Et sådant negativt resultat kan vendes som reaktion på passende indgreb.
Biofilminfektion komplicerer forbrænding og kroniske sår og forårsager kronicitet 1,2,3,4,5. I mikrobiologi studeres primært biofilmmekanismer med fokus på mikroberne 1,6. Erfaringerne fra disse undersøgelser er af afgørende betydning fra et biologisk videnskabeligt synspunkt, men kan ikke nødvendigvis anvendes på klinisk relevante patogene biofilm 6,7,8. Klinisk relevante biofilmstrukturelle aggregater bør omfatte mikrobielle såvel som værtsfaktorer 8,9,10. Et sådant mikromiljø giver mulighed for inkludering af vært-mikrobe iterative interaktioner, som er afgørende for udviklingen af en klinisk relevant biofilm 7,8. I en sådan proces er deltagelsen af immunceller og blodbårne faktorer kritisk11,12. Værtsmikrobeinteraktionerne, der ligger til grund for kliniske patogene biofilm, som det ses i kroniske sår, forekommer over en lang periode. Enhver eksperimentel tilgang, der sigter mod at udvikle en translationelt relevant model for biofilminfektion, skal således tage højde for disse faktorer. Så vi søgte at udvikle en klinisk reproducerbar kronisk biofilminfektionsmodel for svin.
Mens menneskelige studier klart repræsenterer den bedste tilgang til at studere helbredende resultater, er de ofte ikke bedst egnet til at tackle de underliggende mekanismer og nye mekanistiske paradigmer. Etiske bekymringer begrænser brugen af undersøgelsesdesign, der kræver indsamling af flere biopsier fra et kronisk sår på forskellige tidspunkter. Det er derfor afgørende at have en veletableret og reproducerbar dyremodel for at muliggøre invasive undersøgelser til grundig undersøgelse af biofilms skæbne 7,13. Valget af en dyremodel afhænger af flere faktorer, herunder videnskabelig/translationel relevans og logistik. Svinesystemet er bredt anerkendt for at være den mest translationelt værdifulde eksperimentelle model til undersøgelse af menneskelige hudsår7. Således rapporterer dette arbejde en etableret svinemodel af biofilminficeret brændeskade i fuld tykkelse. Dette arbejde er baseret på flere originale publikationer rapporteret i litteraturen 2,7,13,14,15,16,17. I denne undersøgelse blev et klinisk isolat af multiresistent Pseudomonas aeruginosa (PA01) valgt til at inficere såret. P. aeruginosa er en almindelig årsag til sårinfektioner 2,18,19,20. Det er en gramnegativ bakterie, der kan være vanskelig at behandle på grund af dens resistens over for nogle antibiotika11,19,21. Ingen af de hidtil rapporterede svinebiofilmmodeller involverede 8 ugers langtidsundersøgelser 22,23,24,25,26. Kroniske sår er dem, der forbliver åbne i 4 uger eller mere 14,27,28. Der er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapporteret i litteraturen. Dette arbejde omhandler begrebet funktionel sårlukning 2,7,13,15,17,29.
Denne rapport indeholder en detaljeret protokol for opstilling af en svinemodel for kronisk sårbiofilminfektion til eksperimentelle undersøgelser. Flere svinebiofilmmodeller er tidligere rapporteret 22,23,24,25,26, men ingen af dem er svinemodeller, der involverer 8 ugers langtidsundersøgelser. Kroniske sår er dem, der forbliver åbne i 4 uger eller mere 14,27,28. Der er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapporteret i litteraturen. Dette arbejde omhandler begrebet funktionel sårlukning 2,7,13,15,17,29. En undersøgelse foretaget i 2014 var den første til at rapportere, at biofilminficerede sår kan lukke uden genoprettelse af barrierefunktion7. Måling af hudbarrierefunktionen i det helende sår ved hjælp af transepidermalt vandtab (TEWL) rapporteres i dette arbejde.
Anatomisk og fysiologisk er svinehuden sammenlignet med huden hos andre små dyr tættere på den menneskelige hud32,33,34. Både svine- og menneskehud har en tyk epidermis 33, og forholdet mellem dermal og epidermal tykkelse varierer fra 10: 1 til13: 1 hos svin, hvilket kan sammenlignes med mennesker34,35. Histologisk og biomekanisk viser huden hos mennesker og svin ligheder i rete-ridges, subdermalt fedt, dermal kollagen, hårfordeling, adnexale strukturer og blodkarstørrelse og fordeling36,37,38. Funktionelt deler både svin og mennesker ligheder i sammensætningen af lipid-, protein- og keratinkomponenterne i det epidermale lag samt sammenlignelige immunhistologiske mønstre37,38. Immunsystemet hos svin sammenlignet med andre små dyr deler højere ligheder med det menneskelige immunsystem, hvilket betyder, at svin er en passende model til undersøgelser af værtsinteraktionerne, der er integreret i kompleksiteten af den patologiske biofilm i sårinfektioner39. Den kritiske vurdering af fordele og ulemper ved forskellige dyremodeller har ført til konsensus om, at grise repræsenterer en effektiv model til undersøgelse af sårheling34,38. Derudover udvikler tamsvin spontant kroniske bakterielle infektioner, som observeret hos mennesker10. Forbrændingsanordningen, der bruges til at skabe sårene, er en avanceret og automatiseret forbrændingsenhed, der leverer varmeenergi baseret på en temperaturaflæsning fra det målrettede hudsted22,40. En sådan tilgang forbedrer strengheden og reproducerbarheden af forbrændingsskaden. Brugen af humane kliniske isolater af bakterier til at inficere svinesårene tilføjer værdi som en præklinisk model.
Forbrændingsskader er komplekse og forårsager flere systemiske forstyrrelser20,41. Det er således vigtigt at genoplive grisen med tilstrækkelige væsker og forhindre hypotermi under anæstesi og genopretning. Flere faktorer kan forstyrre sårhelingen, herunder ernæring efter forbrænding, væsker og smerter42. Tæt overvågning af ernærings- og smertevurderingerne er derfor af betydning. Smerter efter forbrænding kan være alvorlige og påvirke dyrets adfærd og kost. Interventioner til at løse adfærdsmæssige bekymringer skal overvejes aktivt. Regelmæssig og kontinuerlig smertescoring og styring er afgørende. Et grundigt smertevurderingsark med en meget detaljeret smertehåndteringsplan er inkluderet i denne protokol. For at undgå krydskontaminering mellem sårene skal der lægges særlig vægt på at påføre det første lag af bandagen på hvert sår separat. Der skal udvises kritisk omhu ved håndtering af alle biofarlige materialer og ved udførelse af grundig desinfektion af udstyr, værktøjer og hele operationsrummet. Anvendelsen af flere lag af bandagen forhindrer grisen i at udsætte sårene under deres bestræbelser på at gnide eller ridse kløen tilbage.
Grisen i den nuværende model blev ikke kompromitteret af underliggende metaboliske lidelser (f.eks. diabetes), og derfor var den effekt, der blev undersøgt, udelukkende virkningen af bakteriel biofilminfektion på sårheling. Modellen egner sig imidlertid til induktion af diabetes (f.eks. ved hjælp af streptozococin) og kan bruges til at studere biofilminfektion i forhold til en underliggende metabolisk lidelse. Den anden begrænsning af modellen er den kontrollerede infektionsindstilling ved hjælp af P. aeruginosa, en bakterie. Det forventes, at grisens normale hudmikroflora også kan vokse i såret og kan påvirke helingen. Yderligere analyse ved hjælp af NGS eller andre avancerede teknikker til at afgrænse sårets mikrobielle indhold er nødvendig. Den nuværende model kan også anvendes på blandede infektioner med forskellige mikrobielle arter (f.eks. svampe, virale osv.). Dette er et vigtigt element, da klinisk relevante sår sandsynligvis vil blive befolket af blandede mikrober, hvilket kan påvirke sårheling forskelligt.
Der er mange potentielle fordele ved denne model, herunder ligheden med kompleksiteten og langsigtede følgevirkninger af humane kroniske sår, den automatiserede og reproducerbare forbrændingsproces og brugen af klinisk isolerede bakteriearter. Brugen af flere ikke-invasive billeddannelsesmetoder repræsenterer en kraftfuld tilgang til indsamling af nyttige fysiologiske data, der karakteriserer såret. Endelig er vurderingen af den funktionelle sårheling via genoprettelse af hudens barrierefunktion baseret på TEWL kritisk. Afslutningsvis vises en robust, enkel, detaljeret og brugervenlig protokol til udvikling af en biofilminficeret alvorlig forbrændingsskade ved hjælp af et svinemodelsystem i dette arbejde.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, for deres støtte og dyrlægepleje af dyrene under undersøgelsen. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health tilskud NR015676, NR013898 og DK125835 og Department of Defense grant W81XWH-11-2-0142. Derudover nød dette arbejde godt af følgende National Institutes of Health-priser: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 og NS42617.
Sedation | |||
Ketamine | Zoetis | 10004027 | 100mg/ml |
Telazol | Zoetis | 106-111 | 100mg/ml |
Xylazine | Pivetal | 04606-6750-02 | 100mg/ml Anased |
3ml syringe w/ 20g needle | Covidien-Monoject | 8881513033 | |
Winged infusion set 21g | Jorgensen Labs | J0454B | |
Anesthetic | |||
Isoflurane | Pivetal | 21295097 | |
Surgery | |||
Hair clippers | Wahl | 8787-450A | |
Nair | Church and Dwight Co. Inc | 70506572 | |
Chlorhexidine Solution | First Priority Inc. | 179925722 | |
70% Isopropyl Alcohol | Uline | S-17474 | |
0.9% Saline Solution | ICU Medical | RL-7282 | |
Non-woven gauze | Pivetal | 21295051 | |
Paper tape | McKesson | 455531 | |
2" Elastic tape | Pivetal | 21300869 | |
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Spay hook | Jorgensen Labs | J0112A | |
Sterile lube | McKesson | 16-8942 | |
Laryngoscope | Jorgensen Labs | J0449S | |
Roll gauze | Pivetal | 21295032 | |
Endotracheal tube (7-9mm) | Covidien | 86112 | Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed |
15gtt/ml IV administration set | ICU Medical | 12672-28 | |
LRS 1000ml bag | ICU Medical | 07953-09 | |
Three Quarter Drape Sheet | McKesson | 16-i80-12110G | |
Analgesia | |||
Buprenorphine | RX Generics | 42023-0179-05 | 0.3mg/ml |
Fentanyl Transdermal | |||
Carprofen | 21294548 | Pivetal | 50mg/ml Levafen |
Bandaging | |||
Transparent film dressing 26×30 | Genadyne Biotechnologies | A4-S00F5 | |
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style | McKesson | 886408 | |
Vetrap | 3M | 1410BK BULK | |
Elastic tape 4" | Pivetal | 21300931 | |
Kerlix Roll Gauze | Cardinal Health | 3324 | |
Imaging | |||
Canon EOS 80D | Canon | 1263C004 | |
Speedlight 600EX II-RT | Canon | 1177C002 | |
EFS 17-55mm Ultrasonic | Canon | 1242B002 | |
GE Logiq E9 | GE | 5197104-2 | |
ML6-15 Probe | GE | 5199103 | |
PeriCamPSI | Perimed | 90-00070 | |
DermaLab | Cortex Technologies Inc | 4608D78 | |
Biopsy/Tissue Collection | |||
6mm punch biopsy | Integra Lifesciences | 33-36 | |
bupivicaine 0.5% | Auromedics Pharma | 55150017030 | |
Size 10 Disposable Scalpel | McKesson | 16-63810 | |
Dissection scissors | Pivetal | 21294806 | |
Rat tooth thumb tissue forceps | Aesculap | BD512R | |
Non-adherent Dressing | Covidien | 2132 | Telfa |
50ml Conical tube | Falcon | 352070 | |
Eppendorf/microcentrifuge tube | Fisherbrand | 02-681-320 | |
OCT Cassette | |||
Non Woven Gauze 4×4 | Pivetal | 21295051 | |
Inoculum | |||
Low salt LB agar | Invitrogen | 22700-025 | |
Low salt LB broth | Fisher scientific | BP1427-500 | |
Petri plate | Falcon | REF-351029 | |
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) | Falcon | REF-352059 | |
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) | Thermo Scientific | OXCM0559B | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | 22700025 | |
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | |
Euthanasia | |||
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 9373 |