यहां, हम माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क स्कैनिंग के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लाइव-कंकाल मांसपेशी इमेजिंग द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और अनुदैर्ध्य वितरण में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
माइटोकॉन्ड्रियन एक अंग है जिसे कोशिकाओं की चयापचय आवश्यकताओं के अनुसार लम्बी, खंडित और पुनर्निर्मित किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क की रीमॉडेलिंग स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया को सेलुलर मांगों को पूरा करने की अनुमति देती है; हालांकि, इस क्षमता का नुकसान विभिन्न विकृति विज्ञान के विकास या प्रगति से संबंधित रहा है। कंकाल की मांसपेशियों में, माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण परिवर्तन शारीरिक और रोग स्थितियों जैसे व्यायाम, उम्र बढ़ने और मोटापे में देखे जाते हैं। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क का अध्ययन उन स्थितियों से संबंधित तंत्र की बेहतर समझ प्रदान कर सकता है।
यहां, चूहों से लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर के माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। फाइबर मैन्युअल रूप से एक आराम समाधान में विच्छेदित कर रहे हैं और mitochondria (tetramethylrhodamine एथिल एस्टर, TMRE) के एक फ्लोरोसेंट लाइव सेल इमेजिंग सूचक के साथ ऊष्मायन कर रहे हैं. माइटोकॉन्ड्रिया सिग्नल को इंटरमायोफिब्रिलर माइटोकॉन्ड्रियल (आईएमएफ) नेटवर्क की कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए एक्सवाईजेड स्कैन मोड का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा रिकॉर्ड किया जाता है। उसके बाद, कॉन्फोकल छवियों को थ्रेसहोल्डिंग और बिनाराइजेशन द्वारा संसाधित किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया के लिए सकारात्मक पिक्सेल के लिए द्विरहित कॉन्फोकल छवि खाते हैं, जिन्हें तब माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व प्राप्त करने के लिए गिना जाता है। कंकाल की मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को आईएमएफ आबादी के उच्च घनत्व की विशेषता है, जिसमें टी-नलिकाओं (टीटी) के समान आवधिक अनुदैर्ध्य वितरण होता है। फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) एक मानक विश्लेषण तकनीक है जो टीटी के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए की जाती है जो वितरण आवृत्ति और उनके संगठन के स्तर को खोजने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, एफएफटी एल्गोरिथ्म के कार्यान्वयन को कंकाल की मांसपेशी में अनुदैर्ध्य माइटोकॉन्ड्रियल वितरण के विश्लेषण के लिए वर्णित किया गया है।
माइटोकॉन्ड्रिया अत्यधिक गतिशील नेटवर्क बनाते हैं जो मुख्य रूप से इसके बढ़ाव (संलयन) और विखंडन (विखंडन)1,2के बीच संतुलन द्वारा विनियमित होते हैं, जो मिटोफसिन 1 और 2 (एमएफएन 1 और एमएफएन 2) जैसे प्रोटीन की अभिव्यक्ति और गतिविधि द्वारा संशोधित होते हैं, और ऑप्टिक प्रोटीन शोष 1 (Opa1), जो बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली और आंतरिक झिल्ली के संलयन को नियंत्रित करते हैं, क्रमशः 1,2। डायनामिन से संबंधित प्रोटीन (Drp1) मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन को नियंत्रित करता है जब इसे Ser6163 में फॉस्फोराइलेट किया जाता है।
कंकाल की मांसपेशी में, यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को विभिन्न सेल क्षेत्रों (मायोफिब्रिल, सरकोलेममा और नाभिक)4,5के निकटता के आधार पर संरचनात्मक रूप से अच्छी तरह से परिभाषित उप-जनसंख्या में व्यवस्थित किया गया है। सरकोलेममा के ठीक नीचे स्थित उन माइटोकॉन्ड्रिया को सबसरकोलेमल माइटोकॉन्ड्रिया (एसएसएम) कहा जाता है, जो सिकुड़ा हुआ फिलामेंट्स के बीच स्थित होते हैं उन्हें इंटरमायोफिब्रिलर माइटोकॉन्ड्रिया (आईएमएफ) कहा जाता है, और नाभिक के चारों ओर माइटोकॉन्ड्रियल उप-जनसंख्या को पेरिन्यूक्लियर माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क (पीएमएन) कहा जाता है। इसके अलावा, यह सुझाव दिया गया है कि इन माइटोकॉन्ड्रियल उप-जनसंख्या में क्षेत्र-विशिष्ट कार्य होते हैं और चयापचय रूप से विशिष्ट 4,5 होते हैं।
सेलुलर ऊर्जा होमियोस्टेसिस का रखरखाव, जो चयापचय और सिकुड़ा समारोह की अनुमति देता है, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क (जैसे, आईएमएफ और एसएसएम इंटरैक्शन)4,6के माध्यम से विशिष्ट साइटों पर बातचीत और संचार पर काफी हद तक निर्भर करता है। माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क इंटरैक्शन के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियन अन्य जीवों के साथ भी बातचीत कर सकता है, जिससे संरचनात्मक और कार्यात्मक परिसर बन सकते हैं। इस संबंध में, यह दिखाया गया है कि आईएमएफ सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) के निकट स्थित हो सकता है और अनुप्रस्थ नलिकाओं (टीटी) 7 द्वारा गठित सीए2+ रिलीज इकाइयों (सीआरयू) के निकटता में हो सकता है। एटीपी संश्लेषण और एपोप्टोसिस को विनियमित करने में माइटोकॉन्ड्रियल सीए2 + तेज की भूमिका के कारण यह तथ्य प्रासंगिक है। हाल ही में, साइटोसोलिक सीए को विनियमित करने में एक संभावित भूमिका 2+ यात्रियों को भी8 का सुझाव दिया गया है।
टीटी सरकोलेममा के आक्रमण हैं जिनका आईएमएफ वितरण5 के समान कार्डियोमायोसाइट्स और कंकाल मांसपेशी फाइबर 9,10 के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ आवधिक वितरण होता है। टीटी के वितरण में परिवर्तन के महत्वपूर्ण शारीरिक निहितार्थ हैं, जो सिकुड़ा समारोह में उनकी भूमिका को देखते हैं। हालांकि, इन परिवर्तनों का मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स में मूल्यांकन किया गया है। फास्ट फूरियर ट्रांसफॉर्म (एफएफटी) विश्लेषण का उपयोग दूरी डोमेन से आवृत्ति डोमेन में आवधिक संकेतों के रूपांतरण की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप एक एफएफटी स्पेक्ट्रम होता है जो आवृत्ति और सिग्नल11,12,13की नियमितता को इंगित करता है। हालांकि वहाँ सबूत है कि कंकाल की मांसपेशी फाइबर में mitochondrial नेटवर्क के संगठन विभिन्न चयापचय स्थितियों के लिए अनुकूलन के लिए आवश्यक है, मांसपेशियों की चोट14,15 के बाद उत्थान के दौरान के रूप में, सबसे विश्लेषण गुणात्मक प्रदर्शन कर रहे हैं.
इसके अतिरिक्त, यह देखते हुए कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन कई कंकाल की मांसपेशियों से संबंधित (जैसे, शोष का उपयोग न करें)2 और गैर-मांसपेशी रोगों, विशेष रूप से चयापचय रोगों, और मांसपेशियों के द्रव्यमान (यानी, शोष)16के संबद्ध नुकसान से जुड़ा हुआ है, कंकाल की मांसपेशी में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क और वितरण का मात्रात्मक मूल्यांकन प्रासंगिकता लेता है। हाल ही में, एक मोटे समूह के बीच गैस्ट्रोकेनियस मांसपेशी फाइबर के माइटोकॉन्ड्रिया के अनुदैर्ध्य वितरण में एक महत्वपूर्ण अंतर (ओबी; फ , और एक दुबला समूह (दुबला; जकर +/+ चूहों) की पहचान एफएफटी17 के माध्यम से की गई थी। इस अध्ययन ने माइटोकॉन्ड्रियल वितरण का विश्लेषण करने में एफएफटी की उपयोगिता का प्रदर्शन किया। इसलिए, इस प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त छवियों से रहते कंकाल मांसपेशी फाइबर में माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है. माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व को पृष्ठभूमि थ्रेसहोल्डिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है, और एफएफटी विश्लेषण द्वारा अनुदैर्ध्य माइटोकॉन्ड्रियल वितरण का विश्लेषण भी वर्णित है। एक वर्कफ़्लो योजना चित्रा 1 में प्रस्तुत की गई है।
माइटोकॉन्ड्रिया एक उच्च रीमॉडेलिंग क्षमता वाले अंग हैं। उनकी सामग्री, घनत्व और वितरण को माइटोकॉन्ड्रियल संलयन और विखंडन तंत्र के सक्रियण के माध्यम से तेजी से संशोधित किया जा सकता है, जिसे माइटोकॉन्ड्रियल डायनेमिक्स1 के रूप में जाना जाता है, और माइटोकॉन्ड्रियल टर्नओवर तंत्र के बीच संतुलन: माइटोकॉन्ड्रियल बायोजेनेसिस और विशेष माइटोकॉन्ड्रिया गिरावट मार्ग, माइटोफैगी21,22. माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और आकृति विज्ञान सेल प्रकार और विकास के चरण के अनुसार भिन्न हो सकते हैं और विभिन्न शारीरिक और रोग उत्तेजनाओं 17,22,23,24के तहत फिर से तैयार किया जा सकता है. इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का अध्ययन आधी सदी25 से अधिक के लिए प्रासंगिक रहा है। विशेष रूप से, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण कई अध्ययनों26 में लागू मानक तकनीक रहा है।
कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरोसेंट अध्ययन ने विभिन्न फाइबर गहराई पर माइटोकॉन्ड्रिया के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए उनकी क्षमता के कारण पिछले कुछ वर्षों में प्रासंगिकता प्राप्त की है, जो विभिन्न अनुकूली औरदुर्भावनापूर्ण स्थितियों में कंकाल की मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रिया की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है। इस अध्ययन में, माइटोकॉन्ड्रिया घनत्व के विश्लेषण और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर में वितरण के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है। लाइव-कंकाल मांसपेशी फाइबर के साथ काम करने की मुख्य चुनौतियों में से एक माइटोकॉन्ड्रियल कॉन्फोकल रिकॉर्डिंग तक अलगाव प्रक्रियाओं से संकुचन से बचने के लिए है। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एक उच्च मिलीग्राम और एटीपी आराम समाधान17 का उपयोग फाइबर को कम से कम 2 घंटे के लिए आराम से रखने के लिए किया जाता है, जो फाइबर अलगाव प्रक्रिया, फ्लोरोफोर लोड और कंफोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल के अधिग्रहण के लिए पर्याप्त समय देता है। प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण बिंदु यंत्रवत् फाइबर प्राप्त कर रहा है क्योंकि इसके लिए उच्च परिशुद्धता और ताजा ऊतक की आवश्यकता होती है; हालांकि, यह इस पहले इस्तेमाल किया और रिपोर्ट तकनीक28 के साथ चूहे की मांसपेशियों से व्यवहार्य फाइबर बंडलों प्राप्त करने के लिए संभव है. बरकरार फाइबर प्राप्त करने से सरकोलेममा और इंट्रासेल्युलर वातावरण को संरक्षित करने की अनुमति मिलती है, सेल संरचनाओं28,29 के बीच चयापचय और कार्यात्मक क्रॉसस्टॉक को बनाए रखता है।
ऊतकों या निश्चित कोशिकाओं के साथ काम करने के विपरीत, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा लाइव-सेल इमेजिंग फ्लोरोसेंट छवियों का अधिग्रहण विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के प्रभाव की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग वास्तविक समय में माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण में परिवर्तन का पता लगाने और प्रयोगात्मक समूहों के बीच अंतर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि दुबला और ओब-व्युत्पन्न फाइबर (चित्रा 3 और चित्रा 4) के बीच यहां प्रस्तुत उदाहरण। यह हमेशा माना जाना चाहिए कि लाइव-सेल इमेजिंग मामूली सेल क्षति के साथ इष्टतम काम करने की स्थिति मानकीकरण का तात्पर्य है. काम करने का समय, उपयोग किए गए समाधानों की गुणवत्ता, अधिग्रहण पैरामीटर और लेज़रों के जोखिम को बारीक रूप से नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसलिए, आवश्यक विचारों का उल्लेख नीचे किया गया है।
मांसपेशी फाइबर के माइटोकॉन्ड्रिया को फाइबर के आकार और फाइबर की क्षति के कारण कन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पूरी तरह से अनुदैर्ध्य रूप से दर्ज नहीं किया जा सकता है जो लंबे लेजर एक्सपोजर के कारण हो सकता है। फिर भी, इस तकनीक के तहत फाइबर का एक प्रतिनिधि नमूना दर्ज किया जाता है। यद्यपि यह confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एक चूहे के कंकाल मांसपेशी फाइबर की पूरी मोटाई रिकॉर्ड करने के लिए संभव है, यह एक लंबे समय तक रिकॉर्डिंग समय और लेजर बीम के संपर्क का तात्पर्य है. नियंत्रण चूहों के मामले में, इन रिकॉर्डिंग के साथ मुद्दों का सामना नहीं किया गया है. हालांकि, रोग स्थितियों से फाइबर क्षति के लिए अतिसंवेदनशील हो सकते हैं जैसा कि ओब चूहों से तंतुओं में देखा गया है। नतीजतन, विभिन्न Z दूरी पर प्राप्त प्रतिनिधि confocal छवियों का एक ढेर प्राप्त करना पसंद किया जाता है। जब फाइबर मोटाई का केवल एक खंड दर्ज किया जाता है, तो परीक्षण किए गए सभी तंतुओं पर स्टैक को एक ही गहराई पर लेने की सिफारिश की जाती है क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल वितरण और घनत्व फाइबर के भीतर अपनी स्थिति के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। 15 माइक्रोन से ऊपर की गहराई पर सिग्नल के अधिग्रहण की सिफारिश आईएमएफ के प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियों को प्राप्त करने के लिए की जाती है, जो परिधि के करीब स्थित एसएसएम आबादी से बचती है।
कन्फोकल अधिग्रहण के दौरान, कुछ महत्वपूर्ण विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, आवर्धन, उच्च एनए और विसर्जन माध्यम पर विचार करते हुए विसर्जन उद्देश्य लेंस का चयन। चूंकि कोशिकाओं को हाइड्रोफिलिक इनक्यूबेशन माध्यम में बनाए रखा जाता है, इसलिए इनक्यूबेशन और विसर्जन माध्यम का अपवर्तक सूचकांक एक अच्छा संकेत प्राप्त करने और ऊतक में गहराई से स्कैन करने के लिए समान होना चाहिए। आमतौर पर एक पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करके हासिल किया जाता है। चित्रा 3 और चित्रा 4 की कन्फोकल छवियों को 20x, 0.7 एनए, पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ अधिग्रहित किया गया था। यह उद्देश्य फाइबर के रिकॉर्ड को इसकी सभी गहराई में अनुमति देता है, लेकिन 15, 18 और 21 माइक्रोन पर स्कैनिंग का निर्णय लिया गया था क्योंकि आईएमएफ की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियों को उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता संकेत और मामूली फाइबर क्षति के साथ प्राप्त किया जा सकता है। अन्य आवर्धन, जैसे कि 40x और एक विसर्जन माध्यम के रूप में तेल, पर विचार किया जा सकता है लेकिन इसका मूल्यांकन करने की आवश्यकता है।
दूसरा, इमेजिंग अधिग्रहण के लिए पिक्सेल आकार की गणना Nyquist प्रमेय के अनुसार की जाती है, जो एक उपयुक्त पिक्सेल आकार के चयन की अनुमति देता है जो अधिक नमूना (उच्च लेजर एक्सपोजर) और अंडर-सैंपल (कम रिज़ॉल्यूशन की ओर जाता है)30से बचा जाता है। गणना चयनित उद्देश्य लेंस और तरंग दैर्ध्य (~ 90 एनएम) की विशेषताओं पर निर्भर करती है। इसे ज़ूम के साथ समायोजित किया जा सकता है; इसलिए, केवल एक ज़ूम सेटिंग एक इष्टतम पिक्सेल आकार30 प्रदान करती है। फिर भी, व्यवहार में, ज़ूम विश्लेषण किए जाने वाले नमूने के क्षेत्र पर भी निर्भर करता है। इस प्रकार, संतुलन खोजने से एक पिक्सेल आकार के साथ काम करने की अनुमति मिलती है जो Nyquist मानदंड के सबसे करीब है और यह विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र में भी फिट बैठता है। चित्रा 3 और चित्रा 4 ~ 50-80 माइक्रोन है जो फाइबर की पूरी चौड़ाई के विश्लेषण के लिए अनुमति दी जो 150 और 190 एनएम के एक पिक्सेल आकार के साथ अधिग्रहित किए गए थे.
तीसरा, एक उपयुक्त पिनहोल व्यास जो आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को डिटेक्टर तक पहुंचने से रोकता है, का उपयोग किया जाना चाहिए। आमतौर पर, 1 हवादार को इष्टतम पिनहोल आकार माना जाता है क्योंकि यह फोकस30 के विमान से उत्पन्न होने वाले ~ 80% फोटॉन का पता लगाने की अनुमति देता है। फिर भी, कुछ दाग जैविक नमूने है कि कम प्रतिदीप्ति का स्तर दिखाने के लिए एक पिनहोल वृद्धि30 की आवश्यकता होती है. चित्रा 3 और चित्रा 4 की कन्फोकल छवियों को कम हवादार के साथ कब्जा कर लिया गया कम संकेत के कारण 3 हवादार के पिनहोल आकार के साथ अधिग्रहित किया गया था। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि पिनहोल आकार में वृद्धि के परिणामस्वरूप सिग्नल की तीव्रता में वृद्धि से फोकस से कैप्चर किए गए प्रकाश में वृद्धि के कारण रिज़ॉल्यूशन में कमी आती है। इस कारण से, हमने यथासंभव 1 हवादार के करीब एक पिनहोल आकार का उपयोग करने की सिफारिश की।
जब पर्याप्त रूप से अधिग्रहण किया जाता है, तो माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण पर मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए कॉन्फोकल छवियों को संसाधित किया जा सकता है। भले ही, थ्रेसहोल्डिंग के महत्वपूर्ण प्रसंस्करण छवि कदम को सिग्नल की मात्रा का ठहराव में सुधार करने के लिए विश्लेषण से पहले प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। इस महत्वपूर्ण कदम के दौरान, प्रतिदीप्ति तीव्रता मान है कि पृष्ठभूमि के उन लोगों से mitochondria के लिए सकारात्मक पिक्सल अलग परिभाषित किया गया है. थ्रेशोल्ड को माइटोकॉन्ड्रिया का प्रतिनिधित्व करने वाले शिखर के एक गाऊसी फिट द्वारा परिभाषित किया जा सकता है जब छवि का हिस्टोग्राम दो चोटियों को प्रदर्शित करता है, एक पृष्ठभूमि के अनुरूप और दूसरा माइटोकॉन्ड्रिया के लिए। हालांकि, प्रत्येक छवि में एक बिमोडल वितरण हमेशा प्राप्त नहीं होता है, इसलिए अन्य थ्रेसहोल्डिंग विधियों को लागू करना पड़ता है।
इस प्रोटोकॉल में, ओत्सु की थ्रेसहोल्डिंग के कार्यान्वयन का वर्णन किया गया है, जो एक गैर-पैरामीट्रिक और असुरक्षित विधि है जिसे थ्रेशोल्ड मान खोजने के लिए डिज़ाइन किया गया है जब दो चोटियों को अलग नहीं किया जाता है, या अन्य चोटियों31 मौजूद हैं। ओत्सु को जैविक-छवि विश्लेषण के लिए ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म का उपयोग करके आसानी से लागू किया जा सकता है; हालांकि, अन्य थ्रेसहोल्डिंग विधियों का परीक्षण किया जा सकता है। एक ही थ्रेसहोल्डिंग विधि को सभी कॉन्फोकल छवियों पर लागू किया जाना चाहिए और प्रत्येक कॉन्फोकल छवि के लिए स्वतंत्र रूप से गणना की जानी चाहिए। थ्रेशोल्ड को पूरे स्टैक पर लागू करने से गलत परिणाम मिलते हैं। थ्रेसहोल्डिंग प्रक्रिया के बाद बाइनरी छवियां प्राप्त होने के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और एफएफटी का विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में वर्णित निर्देशों का पालन करके आसानी से किया जा सकता है। हालांकि, नाभिक और केशिकाओं को शामिल करने से बचने के लिए दोनों विश्लेषण करते समय देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि इससे परिमाणीकरण त्रुटियां होंगी। घनत्व के संबंध में, पिक्सेल, या नाभिक या केशिकाओं द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र को पिक्सल या कुल क्षेत्र से विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, एफएफटी विश्लेषण करते समय, यह सत्यापित किया जाना चाहिए कि माइटोकॉन्ड्रिया संकेत सीधा है। इसके विपरीत, जब माइटोकॉन्ड्रिया सिग्नल झुका हुआ होता है, तो यह प्रोफाइल का उत्पादन कर सकता है जो माइटोकॉन्ड्रियल अनुदैर्ध्य वितरण का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, जिससे गलत एफएफटी स्पेक्ट्रम डेटा मिलता है। इसके अलावा, छवियों में शोर को कम करने के लिए एक प्रीप्रोसेसिंग चरण लागू किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक माध्यिका फिल्टर और 2 डी deconvolution का उपयोग कर दो वैकल्पिक preprocessing चरणों का वर्णन करता है. छवि और माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व सामग्री पर इन प्रीप्रोसेसिंग विधियों के प्रभाव पूरक चित्रा एस 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि जबकि ये प्रीप्रोसेस छवि गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं, वे कुछ छवि विवरणों के नुकसान का परिणाम भी दे सकते हैं। इसलिए, उनका उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए और विश्लेषण की जा रही सभी छवियों पर लगातार लागू किया जाना चाहिए।
इसके फायदे के बावजूद, confocal माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण के लिए इष्टतम शर्तों32 लागू कर रहे हैं जब 180-250 एनएम के एक पार्श्व संकल्प (XY) द्वारा सीमित है. माइटोकॉन्ड्रियल व्यास ~ 200-700 एनएम है, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा के करीब है; इस प्रकार, उप mitochondrial संरचनाओं पर्याप्त रूप से33 का पता लगाया नहीं जा सकता है और घनत्व और एफएफटी इस प्रोटोकॉल में दिखाया विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है. इस तरह के स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान), उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी) नैनोस्कोपी, या संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के रूप में माइक्रोस्कोपी के अन्य सुपर संकल्प तकनीकों, उप माइटोकॉन्ड्रियल संरचनाओं32 को हल करने के लिए पता लगाया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, माइटोकॉन्ड्रिया की कॉन्फोकल छवियां फ्लोरोफोर टीएमआरई का उपयोग करके प्राप्त की जाती हैं, जो माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर निर्भर करती हैं। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल फ्लोरोसेंट तीव्रता उनकी झिल्ली क्षमता के अनुसार भिन्न हो सकती है। इस समस्या को दूर करने के लिए डेटा विश्लेषण से पहले एक थ्रेसहोल्डिंग प्रक्रिया की जाती है। एक परिभाषित सीमा से ऊपर के सभी पिक्सेल को उनके प्रतिदीप्ति मूल्य से स्वतंत्र माइटोकॉन्ड्रियल सिग्नल के लिए सकारात्मक माना जाता है। फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बहुत कम झिल्ली क्षमता वाले माइटोकॉन्ड्रिया को इस तकनीक से हल नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सामग्री मात्रा का ठहराव के पूरक अध्ययन की सिफारिश की जाती है। टीएमआरई का उपयोग करने का एक फायदा यह है कि कंफोकल छवियों का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन अयुग्मन एजेंटों के साथ पर्याप्त नियंत्रण करने की आवश्यकता होती है जैसे कार्बोनिलसाइनाइड-पी-ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सीफेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी)। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और वितरण विश्लेषण के निर्देशों को माइटोकॉन्ड्रिया के लिए हरे फ्लोरोसेंट संकेतकों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया को उनकी झिल्ली क्षमता की परवाह किए बिना लोड करते हैं, लेकिन रणनीति और इनक्यूबेशन कंफोकल अधिग्रहण सेटिंग्स को मानकीकृत करने की आवश्यकता होती है।
यह देखते हुए कि माइटोकॉन्ड्रिया संरचना आवश्यक माइटोकॉन्ड्रियल और सेलुलर कार्यों से संबंधित है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल बीमारी के दौरान या किसी विशेष तनाव अपमान से उनके रीमॉडेलिंग के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकता है। यह माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा शासित कंकाल की मांसपेशियों के प्रमुख कार्यों की बेहतर समझ में योगदान दे सकता है, जैसे कि ऊर्जा उत्पादन, या जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया अन्य जीवों के साथ बातचीत करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि संकुचन-चयापचय युग्मन। प्रोटोकॉल निर्देशों के बाद माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व और लाइव-कंकाल की मांसपेशी में वितरण का अनुमान लगाने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल कदम कंकाल मांसपेशी बंडल विच्छेदन, confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, और छवि विश्लेषण, जहां विस्तृत निर्देश और महत्वपूर्ण विचार शामिल हैं पर केंद्रित तीन मुख्य चरणों में विभाजित कर रहे हैं. विशेष रूप से, उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार फाइबर के भीतर पूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल पुनर्निर्माण के लिए अतिरिक्त जेड चरणों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल को और अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कॉन्फोकल छवि और विश्लेषण चरणों को समान वितरण के साथ सेलुलर संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है, जैसे कि लाइव और निश्चित नमूनों में टीटी।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को स्कूल ऑफ मेडिसिन और द इंस्टीट्यूट फॉर ओबेसिटी रिसर्च ऑफ टेक्नोलॉजिको डी मॉन्टेरी द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 3 ए वैज्ञानिक छवि और चित्रण सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया था।
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Forceps | Miltex | MH-18 | |
HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |