यह प्रोटोकॉल डीएनए ओरिगेमी नैनोएंटीना (डीओएनए) का उपयोग करके एकल-अणु सतह-एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) माप को प्रदर्शित करता है, जो कोलोकाइज्ड परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और रमन माप के साथ संयुक्त है।
सरफेस-एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) में एकल अणुओं का पता लगाने की क्षमता होती है जिसके लिए उच्च क्षेत्र वृद्धि की आवश्यकता होती है। एकल-अणु (एसएम) एसईआरएस व्यक्तिगत अणुओं के बारे में अणु-विशिष्ट स्पेक्ट्रोस्कोपिक जानकारी प्रदान करने में सक्षम है और इसलिए अन्य एसएम पहचान तकनीकों की तुलना में अधिक विस्तृत रासायनिक जानकारी देता है। साथ ही, एसएम माप से जानकारी को उजागर करने की क्षमता है जो थोक सामग्री के रमन माप में छिपी हुई है। यह प्रोटोकॉल परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के संयोजन में डीएनए ओरिगेमी नैनोएंटीना (डीओएनए) का उपयोग करके एसएम एसईआरएस माप को रेखांकित करता है। एक डीएनए ओरिगेमी फोर्क संरचना और दो सोने के नैनोकणों को डीओएनए बनाने के लिए जोड़ा जाता है, जिनके बीच 1.2-2.0 एनएम का अंतर होता है। यह 1011 गुना एसईआरएस सिग्नल वृद्धि की अनुमति देता है, जिससे एकल अणुओं के माप को सक्षम किया जा सकता है। प्रोटोकॉल आगे एसईआरएस हॉट स्पॉट में एक एकल विश्लेषण अणु के प्लेसमेंट, एएफएम इमेजिंग की प्रक्रिया और बाद में एक एकल डीओएनए में एक विश्लेषण को मापने के लिए रमन इमेजिंग के ओवरलेइंग को प्रदर्शित करता है।
डीएनए ओरिगेमी एक नैनो टेक्नोलॉजी तकनीक है जिसमें डीएनए स्ट्रैंड को विशिष्ट आकार और पैटर्न में मोड़ना शामिल है। नैनोस्केल पर सटीक नियंत्रण के साथ संरचनाओं को बनाने की क्षमता डीएनए ओरिगेमी1 के प्रमुख लाभों में से एक है। इतने छोटे पैमाने पर पदार्थ में हेरफेर करने की क्षमता में चिकित्सा, इलेक्ट्रॉनिक्स और सामग्री विज्ञानसहित क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला में क्रांति लाने की क्षमता है। उदाहरण के लिए, डीएनए ओरिगेमी संरचनाओं का उपयोग कैंसर कोशिकाओं 3,4 को सीधे दवाओं को वितरित करने के लिए किया गया है, बीमारियों का पता लगाने के लिए नैनोस्केल सेंसर5,6, और सामग्री 6,7 की सतहों पर जटिल पैटर्न बनाते हैं। इसके अलावा, जटिल नैनोस्केल संरचनाओं को बनाने के लिए डीएनए ओरिगेमी का उपयोग करने की क्षमता ने नैनोस्केल8 में मौलिक जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए नए अवसर पैदा किए हैं।
सरफेस एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) एक मजबूत विश्लेषणात्मक तकनीक है जो बेहदकम सांद्रता पर अणुओं का पता लगाती है और उनकी पहचान करती है। यह रमन प्रभाव पर आधारित है, जो बिखरे हुए प्रकाश10 की तरंग दैर्ध्य में परिवर्तन है। एसईआरएस को एक प्लाज्मोनिक धातु सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है ताकि उस पर अधिशोषित अणुओं के रमन संकेत को बढ़ाया जा सके। यह वृद्धि पारंपरिक रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापे गए एक ही अणु से प्राप्त संकेत की तुलना में 1011 गुना अधिक हो सकती है, जिससे एसईआरएसपदार्थों की ट्रेस मात्रा का विश्लेषण करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील विधि बन जाती है।
नैनोकणों की रमन सिग्नल वृद्धि ज्यादातर स्थानीय सतह प्लास्मोन अनुनाद (एलएसपीआर) 12 के उत्तेजना के आधार पर विद्युत चुम्बकीय वृद्धि के कारण होती है। इस घटना में, धातु नैनोपार्टिकल के भीतर इलेक्ट्रॉन प्रकाश की घटना के दौरान धातु नैनोपार्टिकल की सतह के चारों ओर सामूहिक रूप से घूमते हैं। इसके परिणामस्वरूप इलेक्ट्रॉनों की एक स्थायी लहर का निर्माण होता है जिसे सतह प्लास्मोन के रूप में जाना जाता है, जो घटना प्रकाश के साथ प्रतिध्वनित हो सकता है। एलएसपीआर कण की सतह के पास विद्युत क्षेत्र को बहुत बढ़ाता है, और कण का ऑप्टिकल अवशोषण प्लास्मोन अनुनाद आवृत्ति पर अधिकतम होता है। सतह प्लास्मोन की ऊर्जा धातु नैनोपार्टिकल के आकार और आकार के साथ-साथ आसपास के माध्यम13 के गुणों पर निर्भर करती है। प्लाज्मोनिक युग्मन द्वारा एक उच्च वृद्धि प्राप्त की जा सकती है, जैसे कि जब दो नैनोकण व्यास की लंबाई से लगभग 2.5 गुना याकम 14 की दूरी पर एक दूसरे के करीब होते हैं। निकटता दोनों नैनोकणों के एलएसपीआर को एक दूसरे के साथ बातचीत करने का कारण बनती है, जिससे कणों के बीच के अंतर में विद्युत क्षेत्र को परिमाण के कई आदेशों से बढ़ाया जाता है, जो एकल नैनोपार्टिकल15,16,17 की वृद्धि से कहीं अधिक है। वृद्धि का परिमाण नैनोकणों के बीच की दूरी के व्युत्क्रमानुपाती है; जैसे-जैसे दूरी कम होती है, एक महत्वपूर्ण बिंदु दिखाई देता है जहां वृद्धि एकल अणुओं (एसएम) 18 का पता लगाने के लिए पर्याप्त है।
डीएनए ओरिगेमी एक प्रमुख तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है जो प्लाज्मोनिक युग्मन19 का फायदा उठाने और अनुकूलित करने के लिए प्लाज्मोनिक नैनोकणों को कुशलतापूर्वक व्यवस्थित कर सकता है। इसी समय, रुचि के अणुओं को उस स्थान पर ठीक से रखा जा सकता है जहां ऑप्टिकल डिटेक्शन सबसे कुशल है। यह प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए डीएनए ओरिगेमी-आधारित प्लाज्मोनिक नैनोएंटेना के साथ प्रदर्शित किया गयाहै। फ्लोरोसेंट लेबल का पता लगाने के विपरीत, एसईआरएस एक अणु के प्रत्यक्ष रासायनिक फिंगरप्रिंट का पता लगाने की संभावना प्रदान करता है, जिससे एकल-अणु एसईआरएस संवेदन के साथ-साथ रासायनिक प्रतिक्रियाओं और यांत्रिक अध्ययनों की निगरानी के लिए बहुत आकर्षक हो जाता है। डीएनए ओरिगेमी का उपयोग अच्छी तरह से परिभाषित आकृतियों21 के साथ प्लाज्मोनिक नैनोस्ट्रक्चर बनाने के लिए एक मुखौटा के रूप में भी किया जा सकता है, हालांकि लक्ष्य अणुओं को गर्म स्थान में सटीक रूप से रखने की संभावना खो जाती है।
कोलोकाइज्ड एटॉमिक फोर्स माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और रमन माप का उपयोग करके, हम एक एकल डीएनए ओरिगेमी नैनोएंटीना (डीओएनए) से रमन स्पेक्ट्रा प्राप्त कर सकते हैं और संभवतः एक एकल अणु को उच्चतम सिग्नल वृद्धि की स्थिति में रखा जा सकता है। डीओएनए में एक डीएनए ओरिगेमी फोर्क और दो सटीक रूप से स्थित नैनोकण शामिल हैं, जो पूरी तरह से डीएनए ओरिगेमी से जुड़े विस्तारित स्टेपल स्ट्रैंड के पूरक डीएनए के साथ लेपित हैं। डीएनए संकरण पर, नैनोकणों को नैनोपार्टिकल सतहोंके बीच 1.2-2.0 एनएम अंतर के साथ डीएनए ओरिगेमी फोर्क से बांधा जाता है। इस तरह की असेंबली नैनोकणों के बीच एक गर्म स्थान बनाती है, जिसमें 1011 गुना तक की सिग्नल वृद्धि होती है, जैसा कि परिमित अंतर समय डोमेन (एफडीटीडी) सिमुलेशन22 से गणना की जाती है, इस प्रकार एसएम एसईआरएस माप की अनुमति मिलती है। हालांकि, उच्चतम वृद्धि की मात्रा छोटी है (1-10 एनएम3 रेंज में), और परिणामस्वरूप लक्ष्य अणुओं को इस गर्म स्थान में ठीक से तैनात करने की आवश्यकता है। डीएनए ओरिगेमी कांटा डीएनए फोर्क ब्रिज और उपयुक्त युग्मन रसायन विज्ञान का उपयोग करके दो नैनोकणों के बीच एक एकल अणु की स्थिति की अनुमति देता है। फिर भी, रमन स्पेक्ट्रा में ऐसे एसएम का अवलोकन करनाबहुत चुनौतीपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, नैनोकणों को लक्ष्य अणु के साथ पूरी तरह से लेपित किया जा सकता है, जैसे कि टैमरा डाई, उच्च एसईआरएस तीव्रता21 के साथ एकल डीओएनए माप की अनुमति देने के लिए। इस मामले में, टीएएमआरए डीएनए कोटिंग स्ट्रैंड (चित्रा 1) से सहसंयोजक रूप से जुड़ा हुआ है।
एसएम एसईआरएस एक शक्तिशाली उपकरण है जो शोधकर्ताओं को एक नमूना1 के भीतर व्यक्तिगत अणुओं के व्यवहार और बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इस तरह की तकनीक संवेदनशीलता के एक अभूतपूर्व स्तर पर सिस्टम के विश्लेषण की अनुमति देती है, एकल अणुओं के मौलिक व्यवहार और अणुओं के एक समूह पर रासायनिक या भौतिक गुणों के वितरण में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, और रासायनिक प्रक्रियाओं में प्रासंगिक मध्यवर्ती की पहचान करने में मदद करती है। हालांकि, हॉट स्पॉट में एक एकल अणु को रखना जबकि यह भी सुनिश्चित करना कि हॉट स्पॉट में पर्याप्त सतह वृद्धि है,काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित डीओएनए दो सोने के नैनोकणों के बीच गर्म स्थान में एक एकल अणु को ठीक से रख सकता है, जबकि यह सुनिश्चित करता है कि 1011 गुना सतह वृद्धि हो गई है।
एसएम एसईआरएस अध्ययनों के लिए आवश्यक सतह वृद्धि तक पहुंचने के लिए डीओएनए असेंबली के लिए नैनोकणों के बीच का अंतर महत्वपूर्ण है। डीओएनए को 60 और 80 एनएम के बीच आकार के गोलाकार नैनोकणों के लिए अनुकूलित किया गया है। इसके अलावा, नैनोकणों की गुणवत्ता डीएनए ओरिगेमी फोर्क्स के साथ नैनोकणों के संकरण को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकती है; जब कोटिंग चरण में उपयोग किए जाने वाले नैनोकणों 6 महीने से अधिक पुराने होते हैं, तो संकरण की दक्षता में गिरावट शुरू हो जाती है।
प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू यह है कि जिन चरणों के लिए घटकों के बीच सटीक अनुपात की आवश्यकता होती है, उनका ठीक से पालन किया जाना चाहिए, या डीओएनए सही ढंग से नहीं बनेंगे। डीएनए ओरिगेमी कांटा तापमान रैंपिंग प्रोटोकॉल के प्रति बेहद संवेदनशील है, जिसमें संरचना की अखंडता को प्रभावित करने वाले परिवर्तन होते हैं या कांटे बनने से रोकते हैं।
एसईआरएस माप के दौरान अनाकार कार्बन उत्पादन एक महत्वपूर्ण मुद्दा है क्योंकि इसकी चोटियां आमतौर पर कई अणुओं (1,200-1,700 सेमी -1) के लिए फिंगरप्रिंट क्षेत्र के समान सीमा में होती हैं। जबकि गठन अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है, यह आमतौर पर उच्च लेजर शक्ति या लंबे एकीकरण समय28 से जुड़ा होता है। एहतियात के रूप में, सबसे कम लेजर शक्ति और सबसे कम एकीकरण समय संभव का उपयोग किया जाना चाहिए। हालांकि, यह आसानी से पूरा नहीं होता है क्योंकि वांछित एसईआरएस सिग्नल प्राप्त करने और अनाकार कार्बन की पीढ़ी से बचने के बीच संतुलन प्राप्त किया जाना चाहिए।
डीओएनए नैनोकणों के विभिन्न प्रकारों और आकारों के बारे में एसएम प्रणाली के रूप में बहुत बहुमुखी हैं, जिनका उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि चांदी के गोले, सोने के फूल या सितारे। इसके अतिरिक्त, जांच के तहत अणु को आसानी से पुल के बीच में केवल डीएनए स्ट्रैंड को बदलकर प्रतिस्थापित किया जा सकता है, प्रक्रिया में कोई बदलाव नहीं होता है। साइटोक्रोम सी जैसे प्रोटीन पर स्विच करना पुल में एक पाइरिडिन-संशोधित डीएनए कैप्चर स्ट्रैंड होने से किया जा सकता है, जो साइटोक्रोम सी को बांध देगा और यह सुनिश्चित करेगा कि यह एसएम एसईआरएस माप22 के लिए गर्म स्थान पर है। यह विकिरण के लिए लेजर को लचीले ढंग से चुनने का भी अनुवाद करता है, संभावित रूप से एक लेजर का उपयोग करके जो अधिकतम वृद्धि देता है।
सारांश में, यह विधि डोना संरचनाओं को इकट्ठा करने और एकल-अणु सतह-वर्धित रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए उनका उपयोग करने के लिए विश्वसनीय है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी; समेकित अनुदान संख्या 772752) द्वारा समर्थित किया गया था।
100 kDa MWCO Amicon filters, 0.5 mL | Merck | UFC5100BK | |
10x TAE buffer (0.4 M Tris, 0.2 M acetic acid, 0.01 M EDTA) | SIGMA Aldrich | T9650 | |
60 nm goldspheres, bare (citrate) | NanoComposix | AUCN60 | |
ACCESS-NC-A AFM probes | SCHAEFER-TEC | ||
Agarose powder | SIGMA Aldrich | 9012-36-6 | |
AuNP DNA coating strands | IDT | ||
AuNP DNA coating strands (TAMRA) | SIGMA Aldrich | ||
Glycerol | SIGMA Aldrich | 56-81-5 | |
Heraeus Fresco 17 centrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution | HORIBA | ||
Magnesium chloride | SIGMA Aldrich | 7786-30-3 | |
Nanofork DNA bridge strand (TAMRA) | Metabion | ||
Nanofork DNA staple strands | SIGMA Aldrich | ||
ParafilmM | Carl Roth | CNP8.1 | |
Primus 25 Thermocycler | Peqlab/VWR | ||
Silicon wafer | Siegert wafer | BW14076 | |
Single-stranded scaffold DNA, type p7249 (M13mp18) | Tilibit nanosystems | ||
TCEP solution | SIGMA Aldrich | 51805-45-9 |