Denne protokol præsenterer et optimeret løsrevet bladbioassaysystem til evaluering af effektiviteten af entomopatogene svampe (EPF) mod sennepbladlus (Lipaphis erysimi (Kalt.)), Et parthenogenetisk insekt. Metoden skitserer dataindsamlingsprocessen under petriskålforsøg, hvilket gør det muligt for forskere konsekvent at måle virulensen af EPF mod sennepbladlus og andre parthenogenetiske insekter.
Sennepbladlusen (L. erysimi) er et skadedyr, der angriber forskellige korsblomstrede afgrøder og overfører plantevirus. For at opnå miljøvenlig skadedyrsbekæmpelse er entomopatogene svampe (EPF) potentielle mikrobielle bekæmpelsesmidler til bekæmpelse af dette skadedyr. Derfor er virulensscreening af EPF-isolater under petriskålforhold nødvendig før feltpåføring. Imidlertid er sennepbladlusen et parthenogenetisk insekt, hvilket gør det vanskeligt at registrere data under petriskålforsøg. Et modificeret system til løsrevne blade bioassays blev udviklet for at løse dette problem ved hjælp af en mikrosprøjte til at inokulere konidier på bladlus og forhindre drukning ved at lette lufttørring efter sporesuspension. Systemet opretholdt høj relativ luftfugtighed i hele observationsperioden, og bladskiven forblev frisk i over ti dage, hvilket tillod parthenogenetisk reproduktion af bladlusene. For at forhindre opbygning af afkom blev der implementeret en proces med daglig fjernelse ved hjælp af en malebørste. Denne protokol demonstrerer et stabilt system til evaluering af virulensen af EPF-isolater mod sennepsbladlus eller andre bladlus, hvilket gør det muligt at vælge potentielle isolater til bladlusbekæmpelse.
Sennepbladlusen (L. erysimi) er et berygtet skadedyr, der angriber en række korsblomstrede afgrøder, hvilket forårsager betydelige økonomiske tab1. Selv om flere systematiske insekticider er blevet anbefalet til bekæmpelse af bladlusangreb, giver den hyppige anvendelse af disse insekticider anledning til bekymring med hensyn til pesticidresistens 2,3. Med hensyn til miljøvenlig bekæmpelse af skadegørere kan entomopatogene svampe (EPF) derfor tjene som en passende alternativ bekæmpelsesstrategi. EPF er et insektpatogen med evnen til at inficere værter ved at trænge ind i deres neglebånd, hvilket gør det til et potent middel til bekæmpelse af bladlus og andre plantesugende insekter4. Desuden har EPF vist sig at være en gennemførlig og bæredygtig skadedyrsbekæmpelsesteknik, der tilbyder fordele såsom plantepatogenantagonisme og plantevækstfremme5.
EPF kan opnås gennem lokkemad til insektjord eller isoleres fra insektkadavere imarken 6,7. Før yderligere anvendelse af svampeisolater er patogenicitetsscreening imidlertid nødvendig. Der er foretaget flere undersøgelser af effektiviteten af EPF mod bladlus, som er betydelige afgrøde skadedyr, der kan forårsage alvorlig skade 8,9. Sennepbladlus, blandt forskellige arter af bladlus, er blevet testet for modtagelighed for flere stammer af Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. og endda Alternaria, som primært er kendt som en saprofytisk og plantepatogen svamp, men har vist nogle dødelige virkninger mod sennepbladlus10,11,12.
For at evaluere effektiviteten af EPF mod bladlus under laboratoriebetingelser kan bioassays opdeles i to hoveddele: podningskammeret og svampeinokulation. Den nuværende protokol beskriver konstruktionen af et podningskammer, hvor bladlus kan opretholdes ved hjælp af forskellige metoder såsom et udskåret blad med en petiole indpakket i fugtig bomuld, en udskåret bladskive med en petriskål foret med dæmpet filterpapir, direkte vedligeholdelse på potteplanter eller en udskåret bladskive indlejret i vandagar i en petriskål eller beholder10. 11,13. Almindelige metoder til svampeinokulation inkluderer konidisprøjtning, bladlusnedsænkning i en konidiasuspension, bladdypning i en konidiasuspension og planteendofytinokulation11,14,15,16. Mens der findes forskellige podningsmetoder, bør bioassays simulere feltanvendelsesbetingelser. For eksempel i tilfælde af bladdyppet metode12,17 kan effektiviteten af EPF evalueres, men da bladlusene angriber de svampebelastede blade, bliver bladlusens dorsale side, som er et præferentielt penetrationssted, normalt ikke udsat for svampen.
For at evaluere EPF’s afdragicide virkning under laboratoriebetingelser foreslår denne protokol at anvende den løsrevne bladmetode beskrevet af Yokomi og Gottwald18 med nogle modifikationer efterfulgt af konidiainokulation ved hjælp af en mikrosprøjte. Denne metode opretholder ca. 100% fugtighed i bioassaykammeret i mindst syv dage uden at kræve yderligere genopfyldning af vand18,19. Derudover sikrer begrænsning af bladlus til en overflade, at de udsættes for konidier sprøjtning og letter observationer20. Imidlertid kan bladlus sidde fast i den udsatte agaroverflade, mens de bevæger sig inden for podningskammeret. Desuden kan registrering af data i petriskålforsøget med sennepsbladlus, som er parthenogenetiske insekter, være udfordrende på grund af deres hurtige udvikling og reproduktion. Det er vanskeligt at skelne mellem podede voksne og deres afkom uden fjernelse. Detaljerne om, hvordan man fortsætter med dette trin, nævnes sjældent, og nogle inkonsekvente faktorer, såsom bladforbrugsområde, skal optimeres.
Denne protokol demonstrerer et stabilt system til screening af virulensen af EPF-isolater mod sennepsbladlus, hvilket gør det muligt at vælge potentielle isolater mod forskellige bladlusarter fra et omfattende EPF-bibliotek. Markindsamlede bladlus kan identificeres, og der kan etableres en tilstrækkelig laboratoriepopulation af sennepbladlus til at evaluere den apididicide virkning af forskellige svampeisolater ved hjælp af en nem og gennemførlig metode med ensartede resultater. Bladlus har udviklet flere evolutionære mekanismer som reaktion på intenst og gentaget menneskeskabt pres i agroøkosystemer, hvilket udgør udfordringer for fødevaresikkerheden9. Derfor kan denne beskrevne metode udvides til at evaluere potentielle EPF-isolater mod forskellige bladlusarter.
Korsblomstrer, en gruppe grøntsager, er ofte angrebet af flere bladlusarter, herunder sennepbladlus (L. erysimi) og kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Begge arter er blevet rapporteret i Taiwan27, og det er muligt for dem at sameksistere på indsamlingsstedet. For at skelne nært beslægtede bladlusarter anvendte denne undersøgelse en molekylær identifikationsteknik ved hjælp af et multiplexprimersæt21. Ved at designe en mo…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST).
10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
70% ethanol | |||
9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
Chromas | Technelysium | ||
GeneDoc | |||
GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
Microsprayer | |||
MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
SPSS Statistics | IBM | ||
TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |