Évaluation de l’effet aphidicide des champignons entomopathogènes contre l’insecte parthénogénétique, le puceron de la moutarde, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Ce protocole présente un système optimisé d’essais biologiques sur feuilles détachées pour évaluer l’efficacité des champignons entomopathogènes (FPE) contre le puceron de la moutarde (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insecte parthénogénétique. La méthode décrit le processus de collecte de données au cours des expériences sur les boîtes de Pétri, ce qui permet aux chercheurs de mesurer de manière cohérente la virulence de l’EPF contre les pucerons de la moutarde et d’autres insectes parthénogénétiques.
Abstract
Le puceron de la moutarde (L. erysimi) est un ravageur qui infeste diverses cultures crucifères et transmet des virus végétaux. Pour parvenir à une lutte antiparasitaire respectueuse de l’environnement, les champignons entomopathogènes (FPE) sont des agents de lutte microbienne potentiels pour lutter contre ce ravageur. Par conséquent, il est nécessaire de procéder à un dépistage de la virulence des isolats d’EPF dans des conditions de boîte de Pétri avant l’application au champ. Cependant, le puceron de la moutarde est un insecte parthénogénétique, ce qui rend difficile l’enregistrement des données lors des expériences sur les boîtes de Pétri. Un système modifié d’essais biologiques sur feuilles détachées a été mis au point pour résoudre ce problème, en utilisant un micro-pulvérisateur pour inoculer les conidies aux pucerons et prévenir la noyade en facilitant le séchage à l’air après la suspension des spores. Le système a maintenu une humidité relative élevée tout au long de la période d’observation, et le disque foliaire est resté frais pendant plus de dix jours, ce qui a permis la reproduction parthénogénétique des pucerons. Pour éviter l’accumulation de progéniture, un processus d’élimination quotidienne à l’aide d’un pinceau a été mis en place. Ce protocole démontre un système stable d’évaluation de la virulence des isolats d’EPF contre les pucerons de la moutarde ou d’autres pucerons, permettant la sélection d’isolats potentiels pour la lutte contre les pucerons.
Introduction
Le puceron de la moutarde (L. erysimi) est un ravageur notoire qui infeste une variété de cultures crucifères, causant des pertes économiques importantes1. Bien que plusieurs insecticides systématiques aient été recommandés pour lutter contre les infestations de pucerons, l’utilisation fréquente de ces insecticides soulève des inquiétudes quant à la résistance aux pesticides 2,3. Par conséquent, en termes de lutte antiparasitaire respectueuse de l’environnement, les champignons entomopathogènes (FPE) pourraient constituer une stratégie de lutte alternative appropriée. L’EPF est un insecte pathogène capable d’infecter les hôtes en pénétrant dans leurs cuticules, ce qui en fait un agent puissant pour lutter contre les pucerons et autres insectes suceurs de plantes4. De plus, l’EPF s’est avérée être une technique de lutte antiparasitaire réalisable et durable, offrant des avantages tels que l’antagonisme des agents pathogènes des plantes et la promotion de la croissance des plantes5.
L’EPF peut être obtenu par appâtage d’insectes dans le sol ou isolé à partir de cadavres d’insectes sur le terrain 6,7. Cependant, avant de poursuivre l’utilisation d’isolats fongiques, un dépistage de la pathogénicité est nécessaire. Plusieurs études ont été menées sur l’efficacité de l’EPF contre les pucerons, qui sont des ravageurs importants des cultures qui peuvent causer de graves dommages 8,9. Les pucerons de la moutarde, parmi diverses espèces de pucerons, ont été testés pour leur sensibilité à plusieurs souches de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., et même Alternaria, qui est principalement connu comme un champignon saprophyte et phytopathogène, mais qui a montré des effets mortels contre les pucerons de la moutarde10,11,12.
Pour évaluer l’efficacité de l’EPF contre les pucerons dans des conditions de laboratoire, les essais biologiques peuvent être divisés en deux parties principales : la chambre d’inoculation et l’inoculation fongique. Le protocole actuel décrit la construction d’une chambre d’inoculation, où les pucerons peuvent être maintenus à l’aide de diverses méthodes telles qu’une feuille excisée avec un pétiole enveloppé dans du coton humide, un disque foliaire excisé avec une boîte de Pétri tapissée de papier filtre humide, un entretien direct sur les plantes en pot, ou un disque foliaire excisé incrusté dans une gélose à l’eau dans une boîte de Pétri ou un récipient10, Dé 11 et 13. Les méthodes courantes d’inoculation fongique comprennent la pulvérisation des conidies, l’immersion des pucerons dans une suspension de conidies, le trempage des feuilles dans une suspension de conidies et l’inoculation d’endophytes végétaux11,14,15,16. Bien qu’il existe diverses méthodes d’inoculation, les essais biologiques doivent simuler les conditions d’application sur le terrain. Par exemple, dans le cas de la méthode des feuilles trempées12,17, l’efficacité de l’EPF peut être évaluée, mais comme les pucerons infestent les feuilles chargées de champignons, la face dorsale du puceron, qui est un site de pénétration préférentiel, n’est généralement pas exposée au champignon.
Pour évaluer l’effet aphidicide de l’EPF dans des conditions de laboratoire, ce protocole propose d’utiliser la méthode des feuilles détachées décrite par Yokomi et Gottwald18 avec quelques modifications, suivie d’une inoculation des conidies à l’aide d’un micro-pulvérisateur. Cette méthode permet de maintenir environ 100 % d’humidité dans la chambre d’essai biologique pendant au moins sept jours sans nécessiter de réapprovisionnement supplémentaire en eau18,19. De plus, le confinement des pucerons sur une seule surface assure leur exposition à la pulvérisation des conidies et facilite les observations20. Cependant, les pucerons peuvent rester coincés dans la surface exposée de la gélose lorsqu’ils se déplacent dans la chambre d’inoculation. De plus, l’enregistrement des données dans l’expérience de la boîte de Pétri avec les pucerons de la moutarde, qui sont des insectes parthénogénétiques, peut être difficile en raison de leur développement et de leur reproduction rapides. Il est difficile de faire la distinction entre les adultes inoculés et leur progéniture sans prélèvement. Les détails de la façon de procéder à cette étape sont rarement mentionnés, et certains facteurs incohérents, tels que la zone de consommation des feuilles, doivent être optimisés.
Ce protocole démontre un système stable pour le criblage de la virulence des isolats d’EPF contre les pucerons de la moutarde, permettant la sélection d’isolats potentiels contre diverses espèces de pucerons à partir d’une vaste bibliothèque d’EPF. Les pucerons récoltés sur le terrain peuvent être identifiés et une population suffisante de pucerons de la moutarde en laboratoire peut être établie pour évaluer l’effet aphidicide de divers isolats fongiques à l’aide d’une méthodologie simple et réalisable avec des résultats cohérents. Les pucerons ont développé de multiples mécanismes évolutifs en réponse à des pressions anthropiques intenses et répétées dans les agroécosystèmes, ce qui pose des défis à la sécurité alimentaire9. Par conséquent, cette méthode décrite pourrait être étendue à l’évaluation des isolats potentiels d’EPF contre diverses espèces de pucerons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les crucifères, un groupe de légumes, sont fréquemment infestés par de multiples espèces de pucerons, dont le puceron de la moutarde (L. erysimi) et le puceron du chou (Brevicoryne brassicae)26. Les deux espèces ont été signalées à Taïwan27, et il est possible qu’elles coexistent sur le site de collecte. Pour distinguer les espèces de pucerons étroitement apparentées, cette étude a utilisé une technique d’identification moléculaire à …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le 109-2313-B-005 -048 -MY3 du ministère de la Science et de la Technologie (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
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