Bewertung der aphidiziden Wirkung entomopathogener Pilze gegen parthenogenetisches Insekt, Senfblattlaus, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Dieses Protokoll stellt ein optimiertes Bioassay-System für abgetrennte Blätter vor, um die Wirksamkeit von entomopathogenen Pilzen (EPF) gegen die Senfblattlaus (Lipaphis erysimi (Kalt.)), ein parthenogetisches Insekt, zu bewerten. Die Methode beschreibt den Prozess der Datenerhebung während Petrischalenexperimenten und ermöglicht es den Forschern, die Virulenz von EPF gegen Senfblattläuse und andere parthenogenetische Insekten konsistent zu messen.
Abstract
Die Senfblattlaus (L. erysimi) ist ein Schädling, der verschiedene Kreuzblütler befällt und Pflanzenviren überträgt. Um eine umweltfreundliche Schädlingsbekämpfung zu erreichen, sind entomopathogene Pilze (EPF) potenzielle mikrobielle Bekämpfungsmittel zur Bekämpfung dieses Schädlings. Daher ist ein Virulenz-Screening von EPF-Isolaten unter Petrischalenbedingungen vor der Feldanwendung notwendig. Die Senfblattlaus ist jedoch ein parthenogenetisches Insekt, was die Datenerfassung bei Petrischalenexperimenten erschwert. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein modifiziertes System für Bioassays mit abgetrennten Blättern entwickelt, bei dem ein Mikrosprühgerät verwendet wird, um Konidien auf Blattläuse zu impfen und das Ertrinken zu verhindern, indem das Trocknen an der Luft nach der Sporensuspension erleichtert wird. Das System hielt während des gesamten Beobachtungszeitraums eine hohe relative Luftfeuchtigkeit aufrecht, und die Blattscheibe blieb über zehn Tage frisch, was eine parthenogenetische Vermehrung der Blattläuse ermöglichte. Um die Ansammlung von Nachkommen zu verhindern, wurde ein tägliches Entfernen mit einem Pinsel eingeführt. Dieses Protokoll demonstriert ein stabiles System zur Bewertung der Virulenz von EPF-Isolaten gegen Senfblattläuse oder andere Blattläuse, das die Auswahl potenzieller Isolate zur Blattlausbekämpfung ermöglicht.
Introduction
Die Senfblattlaus (L. erysimi) ist ein berüchtigter Schädling, der eine Vielzahl von Kreuzblütlern befällt und erhebliche wirtschaftliche Verluste verursacht1. Während mehrere systematische Insektizide zur Bekämpfung des Blattlausbefalls empfohlen wurden, gibt der häufige Einsatz dieser Insektizide Anlass zur Besorgnis über die Pestizidresistenz 2,3. Im Sinne einer umweltfreundlichen Schädlingsbekämpfung könnten daher entomopathogene Pilze (EPF) als geeignete alternative Bekämpfungsstrategie dienen. EPF ist ein Insektenpathogen mit der Fähigkeit, Wirte zu infizieren, indem es in ihre Kutikula eindringt, was es zu einem wirksamen Mittel zur Bekämpfung von Blattläusen und anderen pflanzensaugenden Insekten macht4. Darüber hinaus hat sich EPF als praktikable und nachhaltige Schädlingsbekämpfungstechnik erwiesen, die Vorteile wie den Antagonismus von Pflanzenpathogenen und die Förderung des Pflanzenwachstums bietet5.
EPF kann durch Insekten-Boden-Köder gewonnen oder aus Insektenkadavern im Feld isoliert werden 6,7. Vor der weiteren Verwendung von Pilzisolaten ist jedoch ein Pathogenitätsscreening erforderlich. Es wurden mehrere Studien zur Wirksamkeit von EPF gegen Blattläuse durchgeführt, bei denen es sich um bedeutende Pflanzenschädlinge handelt, die schwere Schäden verursachen können 8,9. Senfblattläuse wurden unter verschiedenen Arten von Blattläusen auf ihre Anfälligkeit für verschiedene Stämme von Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. und sogar Alternaria getestet, die in erster Linie als saprophytischer und pflanzenpathogener Pilz bekannt ist, aber einige tödliche Wirkungen gegen Senfblattläuse gezeigt hat10,11,12.
Um die Wirksamkeit von EPF gegen Blattläuse unter Laborbedingungen zu bewerten, können Bioassays in zwei Hauptteile unterteilt werden: die Impfkammer und die Pilzinokulation. Das aktuelle Protokoll beschreibt den Bau einer Impfkammer, in der Blattläuse mit verschiedenen Methoden gepflegt werden können, wie z. B. ein herausgeschnittenes Blatt mit einem Blattstiel, der in feuchte Watte eingewickelt ist, eine herausgeschnittene Blattscheibe mit einer Petrischale, die mit gedämpftem Filterpapier ausgekleidet ist, die direkte Pflege an Topfpflanzen oder eine herausgeschnittene Blattscheibe, die in Wasseragar eingebettet ist, in einer Petrischale oder einem Behälter10, 11,13. Gängige Methoden zur Pilzinokulation sind das Besprühen von Konidien, das Eintauchen von Blattläusen in eine Konidiensuspension, das Eintauchen von Blättern in eine Konidiensuspension und die Endophytenimpfung von Pflanzen11,14,15,16. Es gibt zwar verschiedene Inokulationsmethoden, aber die Bioassays sollen die Bedingungen der Feldanwendung simulieren. Zum Beispiel kann im Fall der in Blätter getauchten Methode12,17 die Wirksamkeit von EPF bewertet werden, aber da die Blattläuse die pilzbeladenen Blätter befallen, wird die dorsale Seite der Blattlaus, die eine bevorzugte Penetrationsstelle ist, dem Pilz normalerweise nicht ausgesetzt.
Um die aphidizide Wirkung von EPF unter Laborbedingungen zu bewerten, schlägt dieses Protokoll die Verwendung der von Yokomi und Gottwald18 beschriebenen Methode mit abgetrennten Blättern mit einigen Modifikationen vor, gefolgt von einer Konidieninokulation mit einem Mikrosprühgerät. Bei dieser Methode wird die Luftfeuchtigkeit in der Bioassay-Kammer mindestens sieben Tage lang auf etwa 100 % gehalten, ohne dass zusätzliches Wasser nachgefüllt werden muss18,19. Darüber hinaus stellt die Beschränkung von Blattläusen auf eine Oberfläche sicher, dass sie dem Besprühen von Konidien ausgesetzt sind, und erleichtert die Beobachtungen20. Blattläuse können jedoch in der exponierten Agaroberfläche stecken bleiben, während sie sich in der Impfkammer bewegen. Darüber hinaus kann die Datenerfassung im Petrischalen-Experiment mit Senfblattläusen, die zu den parthenogenetischen Insekten gehören, aufgrund ihrer schnellen Entwicklung und Vermehrung eine Herausforderung darstellen. Es ist schwierig, zwischen geimpften Erwachsenen und ihren Nachkommen zu unterscheiden, ohne sie zu entfernen. Die Details, wie mit diesem Schritt vorzugehen ist, werden selten erwähnt, und einige inkonsistente Faktoren, wie z. B. die Blattverzehrfläche, müssen optimiert werden.
Dieses Protokoll demonstriert ein stabiles System für das Screening der Virulenz von EPF-Isolaten gegen Senfblattläuse, das die Auswahl potenzieller Isolate gegen verschiedene Blattlausarten aus einer umfangreichen EPF-Bibliothek ermöglicht. Im Feld gesammelte Blattläuse können identifiziert werden, und eine ausreichende Laborpopulation von Senfblattläusen kann etabliert werden, um die aphidizide Wirkung verschiedener Pilzisolate mit einer einfachen und praktikablen Methodik mit konsistenten Ergebnissen zu bewerten. Blattläuse haben als Reaktion auf intensive und wiederholte anthropogene Belastungen in Agrarökosystemen mehrere evolutionäre Mechanismen entwickelt, die die Ernährungssicherheit vor Herausforderungen stellen9. Daher könnte diese beschriebene Methode erweitert werden, um potentielle EPF-Isolate gegen verschiedene Blattlausarten zu evaluieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kreuzblütler, eine Gruppe von Gemüsesorten, sind häufig von mehreren Blattlausarten befallen, darunter Senfblattlaus (L. erysimi) und Kohlblattlaus (Brevicoryne brassicae)26. Beide Arten wurden in Taiwan27 gemeldet, und es ist möglich, dass sie an der Sammelstelle koexistieren. Zur Unterscheidung eng verwandter Blattlausarten wurde in dieser Studie eine molekulare Identifizierungstechnik unter Verwendung eines Multiplex-Primer-Sets21<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch 109-2313-B-005 -048 -MY3 vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) unterstützt.
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
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