単為生殖昆虫、カラショウアブラムシ、 Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
このプロトコルはマスタードアブラムシ(Lipaphis erysimi (Kalt.))、単為生殖の昆虫に対する昆虫病原性の菌類(EPF)の有効性を評価するための最大限に活用された一戸建ての葉の生物検定システムを示す。この手法は、ペトリ皿実験中のデータ収集プロセスの概要を示しており、研究者はマスタードアブラムシやその他の単為生殖昆虫に対するEPFの病原性を一貫して測定することができます。
Abstract
カラシナアブラムシ(L. erysimi)は、さまざまなアブラナ科の作物に寄生し、植物ウイルスを媒介する害虫です。環境にやさしい病害虫管理を実現するために、昆虫病原性真菌(EPF)は、この害虫を防除するための微生物防除剤として期待されています。したがって、ペトリ皿条件下でのEPF分離株の病原性スクリーニングは、フィールドアプリケーションの前に必要です。しかし、カラシナアブラムシは単為生殖性の昆虫であるため、ペトリ皿実験中のデータ記録は困難です。この問題に対処するために、マイクロ噴霧器を使用してアブラムシに分生子を接種し、胞子懸濁後の自然乾燥を容易にすることで溺死を防ぐという、分離葉バイオアッセイ用の改良システムを開発しました。観察期間中、高い相対湿度が保たれ、葉の円盤は10日以上新鮮に保たれ、アブラムシの単為生殖が可能であった。子孫の蓄積を防ぐために、ペイントブラシを使用して毎日除去するプロセスが実施されました。このプロトコルは、マスタードアブラムシまたは他のアブラムシに対してEPF分離株の病原性を評価するための安定したシステムを実証し、アブラムシ防除のための潜在的な分離株の選択を可能にします。
Introduction
カラシナアブラムシ(L. erysimi)は、さまざまなアブラナ科作物に蔓延し、重大な経済的損失を引き起こす悪名高い害虫です1。アブラムシの蔓延と戦うためにいくつかの体系的な殺虫剤が推奨されていますが、これらの殺虫剤の頻繁な使用は、農薬耐性に関する懸念を引き起こします2,3。したがって、環境に優しい害虫管理の観点から、昆虫病原性真菌(EPF)は適切な代替防除戦略として役立つ可能性があります。EPFは、宿主のクチクラを貫通して感染する能力を持つ昆虫病原体であり、アブラムシやその他の植物吸引昆虫を駆除するための強力な薬剤となっています4。さらに、EPFは実行可能で持続可能な害虫管理技術であることが証明されており、植物病原菌拮抗作用や植物の成長促進などの利点を提供します5。
EPFは、昆虫と土壌の餌付けによって得るか、または野外で昆虫の死体から単離することができる6,7。ただし、真菌分離株をさらに使用する前に、病原性スクリーニングが必要です。深刻な被害を引き起こす可能性のある重大な作物害虫であるアブラムシに対するEPFの有効性について、いくつかの研究が行われています8,9。マスタードアブラムシは、アブラムシのさまざまな種の中で、Beauveria spp.、Metarhizium spp.、Lecanicillium spp.、Paecilomyces spp.、さらには主に腐生性および植物病原性真菌として知られているが、マスタードアブラムシに対していくつかの致命的な影響を示しているAlternariaのいくつかの株に対する感受性についてテストされています10,11,12。
実験室条件下でアブラムシに対するEPFの有効性を評価するために、バイオアッセイは、接種チャンバーと真菌接種の2つの主要な部分に分けることができます。現在のプロトコルは、湿った綿で包まれた葉柄で切除された葉、湿った濾紙で裏打ちされたペトリ皿を備えた切除された葉の円盤、鉢植えの植物の直接メンテナンス、またはペトリ皿または容器内の水寒天に埋め込まれた切除された葉の円盤などのさまざまな方法を使用してアブラムシを維持できる接種チャンバーの構築を説明しています10。 11、13。真菌接種の一般的な方法には、分生子の散布、分生子懸濁液へのアブラムシの浸漬、分生子懸濁液への葉の浸漬、および植物内生菌接種が含まれます11,14,15,16。さまざまな接種方法がありますが、バイオアッセイはフィールドアプリケーション条件をシミュレートする必要があります。例えば、葉浸漬法12,17の場合、EPFの効率は評価できるが、アブラムシは菌を積んだ葉に寄生するため、優先侵入部位であるアブラムシの背側は、通常、真菌に曝露されない。
実験室条件下でEPFの殺虫効果を評価するために、このプロトコルは、YokomiとGottwald18によって記述されている分離葉法を使用し、いくつかの修正を加え、マイクロ噴霧器を使用して分生子を接種することを提案しています。この方法は、バイオアッセイチャンバー内の湿度を少なくとも7日間、水の追加補充を必要とせずに約100%に維持する18,19。さらに、アブラムシを1つの表面に閉じ込めることで、分生子散布への曝露が保証され、観察が容易になります20。しかし、アブラムシは接種室内を移動している間に露出した寒天表面に引っかかってしまうことがあります。さらに、単為生殖の昆虫であるカラシナアブラムシのペトリ皿実験でのデータ記録は、発生と繁殖が速いため、困難な場合があります。接種した成体とその子孫を除去せずに区別することは困難です。このステップの進め方の詳細が言及されることはめったになく、葉の消費面積など、いくつかの一貫性のない要因を最適化する必要があります。
このプロトコルは、マスタードアブラムシに対してEPF分離株の病原性をスクリーニングするための安定したシステムを示しており、広範なEPFライブラリからさまざまなアブラムシ種に対して潜在的な分離株の選択を可能にします。野外で採取されたアブラムシを同定し、マスタードアブラムシの十分な実験室集団を確立して、一貫した結果をもたらす簡単で実行可能な方法論を使用して、さまざまな真菌分離株のアブシド効果を評価することができます。アブラムシは、農業生態系における強烈かつ繰り返される人為的圧力に反応して複数の進化メカニズムを発達させており、食料安全保障に課題をもたらしている9。したがって、この記載された方法は、さまざまなアブラムシ種に対する潜在的なEPF分離株を評価するために拡張できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
野菜のグループであるアブラナ科は、マスタードアブラムシ(L. erysimi)やキャベツアブラムシ(Brevicoryne brassicae)など、複数のアブラムシ種が頻繁に寄生しています26。台湾では27種とも報告されており、採集地では共存している可能性がある。近縁のアブラムシ種を区別するために、本研究ではマルチプレックスプライマーセット21</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、科学技術省(MOST)の109-2313-B-005 -048 -MY3の支援を受けました。
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
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