Vurdering av aphidicid effekt av entomopatogene sopp mot partenogenetisk insekt, sennepsbladlus, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Denne protokollen presenterer et optimalisert frittliggende bladbioassay-system for å evaluere effektiviteten av entomopatogene sopp (EPF) mot sennepsbladlusen (Lipaphis erysimi (Kalt.)), et parthenogenetisk insekt. Metoden skisserer datainnsamlingsprosessen under petriskåleksperimenter, slik at forskere konsekvent kan måle virulensen av EPF mot sennepsbladlus og andre parthenogenetiske insekter.
Abstract
Sennepsbladlusen (L. erysimi) er et som infiserer ulike cruciferous avlinger og overfører plantevirus. For å oppnå miljøvennlig skadedyrsbekjempelse er entomopatogene sopp (EPF) potensielle mikrobielle kontrollmidler for å kontrollere dette. Derfor er virulensscreening av EPF-isolater under petriskålforhold nødvendig før feltpåføring. Imidlertid er sennepsbladlusen et parthenogenetisk insekt, noe som gjør det vanskelig å registrere data under petriskåleksperimenter. Et modifisert system for frittliggende bladbioassays ble utviklet for å løse dette problemet, ved hjelp av en mikrosprøyte for å inokulere konidier på bladlus og forhindre drukning ved å lette lufttørking etter sporesuspensjon. Systemet opprettholdt høy relativ luftfuktighet gjennom hele observasjonsperioden, og bladskiven holdt seg frisk i over ti dager, noe som tillot partenogenetisk reproduksjon av bladlusene. For å forhindre avkomoppbygging ble det gjennomført en prosess med daglig fjerning ved hjelp av en pensel. Denne protokollen demonstrerer et stabilt system for evaluering av virulensen av EPF-isolater mot sennepsbladlus eller andre bladlus, noe som gjør det mulig å velge potensielle isolater for bladluskontroll.
Introduction
Sennepsbladlusen (L. erysimi) er et beryktet som infiserer en rekke cruciferous avlinger, noe som forårsaker betydelige økonomiske tap1. Mens flere systematiske insektmidler har blitt anbefalt for å bekjempe bladlusangrep, gir hyppig bruk av disse insektmidler bekymringer om plantevernmiddelresistens 2,3. Derfor, når det gjelder miljøvennlig skadedyrsbekjempelse, kan entomopatogene sopp (EPF) tjene som en egnet alternativ kontrollstrategi. EPF er et insektpatogen med evnen til å infisere verter ved å trenge inn i neglebåndene, noe som gjør det til et kraftig middel for å kontrollere bladlus og andre plantesugende insekter4. Videre har EPF vist seg å være en gjennomførbar og bærekraftig skadedyrsbekjempelsesteknikk, og tilbyr fordeler som plantepatogenantagonisme og plantevekstfremmende5.
EPF kan oppnås gjennom insekt-jord baiting eller isolert fra insektkadavre i feltet 6,7. Men før videre bruk av soppisolater, er patogenicitet screening nødvendig. Flere studier har blitt utført på effektiviteten av EPF mot bladlus, som er betydelige som kan forårsake alvorlig skade 8,9. Sennepsbladlus, blant forskjellige arter av bladlus, har blitt testet for følsomhet for flere stammer av Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., og til og med Alternaria, som primært er kjent som en saprofytisk og plantepatogen sopp, men har vist noen dødelige effekter mot sennepsbladlus10,11,12.
For å evaluere effektiviteten av EPF mot bladlus under laboratorieforhold, kan bioassays deles inn i to hoveddeler: inokulasjonskammeret og soppinokulering. Den nåværende protokollen beskriver konstruksjonen av et inokulasjonskammer, hvor bladlus kan opprettholdes ved hjelp av forskjellige metoder som et utskåret blad med en petiole innpakket i fuktig bomull, en utskåret bladskive med en petriskål foret med dempet filterpapir, direkte vedlikehold på potteplanter eller en utskåret bladskive innebygd i vannagar i en petriskål eller beholder10, 11,13. Vanlige metoder for soppinokulering inkluderer conidia-sprøyting, bladlusnedsenking i en conidia-suspensjon, bladdypping i en conidia-suspensjon og planteendofyttinokulering11,14,15,16. Mens ulike inokulasjonsmetoder eksisterer, bør bioassayene simulere feltapplikasjonsforhold. For eksempel, når det gjelder bladdyppet metode12,17, kan effektiviteten av EPF evalueres, men siden bladlusene angriper de soppbelastede bladene, blir den dorsale siden av bladlusen, som er et fortrinnsvis penetrasjonssted, vanligvis ikke utsatt for soppen.
For å evaluere den aphidicide effekten av EPF under laboratorieforhold, foreslår denne protokollen å bruke frittliggende bladmetode beskrevet av Yokomi og Gottwald18 med noen modifikasjoner, etterfulgt av konidia-inokulering ved bruk av en mikrosprøyter. Denne metoden opprettholder omtrent 100% fuktighet i bioassaykammeret i minst syv dager uten å kreve ytterligere etterfylling av vann18,19. I tillegg sikrer begrensning av bladlus til en overflate deres eksponering for conidia-sprøyting og letter observasjoner20. Imidlertid kan bladlus bli sittende fast i den eksponerte agaroverflaten mens de beveger seg i inokulasjonskammeret. Videre kan registrering av data i petriskåleksperimentet med sennepsbladlus, som er parthenogenetiske insekter, være utfordrende på grunn av deres raske utvikling og reproduksjon. Det er vanskelig å skille mellom inokulerte voksne og deres avkom uten fjerning. Detaljene om hvordan du går frem med dette trinnet blir sjelden nevnt, og noen inkonsekvente faktorer, for eksempel bladforbruksområdet, må optimaliseres.
Denne protokollen demonstrerer et stabilt system for screening av virulensen av EPF-isolater mot sennepsbladlus, noe som gjør det mulig å velge potensielle isolater mot forskjellige bladlusarter fra et omfattende EPF-bibliotek. Feltsamlet bladlus kan identifiseres, og en tilstrekkelig laboratoriepopulasjon av sennepsbladlus kan etableres for å evaluere den afhidicide effekten av forskjellige soppisolater ved hjelp av en enkel og gjennomførbar metodikk med konsistente resultater. Bladlus har utviklet flere evolusjonære mekanismer som svar på intenst og gjentatt menneskeskapt press i agroøkosystemer, noe som utgjør utfordringer for matsikkerhet9. Derfor kan denne beskrevne metoden utvides til å evaluere potensielle EPF-isolater mot forskjellige bladlusarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Crucifers, en gruppe grønnsaker, er ofte infisert av flere bladlusarter, inkludert sennepsbladlus (L. erysimi) og kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Begge artene er rapportert i Taiwan27, og det er mulig for dem å sameksistere på innsamlingsstedet. For å skille nært beslektede bladlusarter, benyttet denne studien en molekylær identifikasjonsteknikk ved hjelp av et multiplexprimersett21. Ved å designe en molekylær markør…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
