Bedömning av afidicid effekt av entomopatogena svampar mot partenogenetisk insekt, senapsbladlus, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Summary
Detta protokoll presenterar ett optimerat bioanalyssystem för fristående blad för att utvärdera effektiviteten av entomopatogena svampar (EPF) mot senapsbladlusen (Lipaphis erysimi (Kalt.)), en partenogenetisk insekt. Metoden beskriver datainsamlingsprocessen under petriskålsexperiment, vilket gör det möjligt för forskare att konsekvent mäta EPF:s virulens mot senapsbladlöss och andra partenogenetiska insekter.
Abstract
Senapsbladlusen (L. erysimi) är en skadegörare som angriper olika korsblommiga grödor och överför växtvirus. För att uppnå miljövänlig skadedjursbekämpning är entomopatogena svampar (EPF) potentiella mikrobiella bekämpningsmedel för att bekämpa denna skadegörare. Därför är virulensscreening av EPF-isolat under petriskålförhållanden nödvändig före fältapplicering. Senapsbladlusen är dock en partenogenetisk insekt, vilket gör det svårt att registrera data under petriskålsexperiment. Ett modifierat system för bioanalyser av fristående blad utvecklades för att ta itu med detta problem, med hjälp av en mikrospruta för att inokulera konidier på bladlöss och förhindra drunkning genom att underlätta lufttorkning efter sporsuspension. Systemet bibehöll hög relativ luftfuktighet under hela observationsperioden, och bladskivan förblev fräsch i över tio dagar, vilket möjliggjorde partenogenetisk reproduktion av bladlössen. För att förhindra ansamling av avkommor implementerades en process med daglig borttagning med hjälp av en målarpensel. Detta protokoll visar ett stabilt system för att utvärdera virulensen hos EPF-isolat mot senapsbladlöss eller andra bladlöss, vilket gör det möjligt att välja potentiella isolat för bladlusbekämpning.
Introduction
Senapsbladlusen (L. erysimi) är en ökänd skadegörare som angriper en mängd olika korsblommiga grödor och orsakar betydande ekonomiska förluster1. Flera systematiska insekticider har rekommenderats för att bekämpa bladlusangrepp, men den frekventa användningen av dessa insekticider ger upphov till farhågor om resistens mot bekämpningsmedel 2,3. När det gäller miljövänligt växtskydd kan entomopatogena svampar därför fungera som en lämplig alternativ bekämpningsstrategi. EPF är en insektspatogen med förmågan att infektera värdar genom att tränga in i deras nagelband, vilket gör den till ett potent medel för att bekämpa bladlöss och andra växtsugande insekter4. Dessutom har EPF visat sig vara en genomförbar och hållbar teknik för skadedjursbekämpning, som erbjuder fördelar som antagonism mot växtpatogener och främjande av växttillväxt5.
EPF kan erhållas genom bete med insektsjord eller isoleras från insektskadaver i fält 6,7. Innan ytterligare användning av svampisolat är det dock nödvändigt att göra en screening av patogeniciteten. Flera studier har genomförts om EPF:s effektivitet mot bladlöss, som är betydande skadegörare på grödor som kan orsaka allvarliga skador 8,9. Senapsbladlöss, bland olika arter av bladlöss, har testats för känslighet för flera stammar av Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., och till och med Alternaria, som främst är känd som en saprofytisk och växtpatogen svamp men har visat vissa dödliga effekter mot senapsbladlöss10,11,12.
För att utvärdera EPF:s effektivitet mot bladlöss under laboratorieförhållanden kan bioassays delas in i två huvuddelar: inokuleringskammaren och svampinokulering. Det nuvarande protokollet beskriver konstruktionen av en inokuleringskammare, där bladlöss kan underhållas med hjälp av olika metoder, t.ex. ett utskuret blad med ett bladskaft inlindat i fuktig bomull, en utskuren bladskiva med en petriskål fodrad med fuktat filterpapper, direkt underhåll på krukväxter eller en utskuren bladskiva inbäddad i vattenagar i en petriskål eller behållare10. 11,13. Vanliga metoder för svampinokulering inkluderar konidisprutning, bladlusnedsänkning i en konidisuspension, bladdoppning i en konidisuspension och ympning av växtendofyter11,14,15,16. Även om det finns olika inokuleringsmetoder bör bioassayerna simulera appliceringsförhållanden i fält. Till exempel, i fallet med bladdoppningsmetoden12,17, kan effektiviteten av EPF utvärderas, men eftersom bladlössen angriper de svampladdade bladen, utsätts bladlössens ryggsida, som är en föredragen penetrationsplats, vanligtvis inte för svampen.
För att utvärdera den afhidicida effekten av EPF under laboratorieförhållanden föreslår detta protokoll att man använder metoden med fristående blad som beskrivs av Yokomi och Gottwald18 med vissa modifieringar, följt av konidiinokulering med hjälp av en mikrospruta. Denna metod bibehåller cirka 100 % luftfuktighet i bioanalyskammaren i minst sju dagar utan att kräva ytterligare påfyllning av vatten18,19. Att begränsa bladlöss till en yta säkerställer dessutom att de utsätts för konidisprutning och underlättar observationer20. Bladlöss kan dock fastna i den exponerade agarytan när de rör sig i inokuleringskammaren. Dessutom kan det vara svårt att registrera data i petriskålsförsöket med senapsbladlöss, som är partenogenetiska insekter, på grund av deras snabba utveckling och reproduktion. Det är svårt att skilja mellan vaccinerade vuxna individer och deras avkomma utan avlägsnande. Detaljerna om hur man går vidare med detta steg nämns sällan, och vissa inkonsekventa faktorer, såsom bladförbrukningsyta, måste optimeras.
Detta protokoll visar ett stabilt system för screening av virulensen hos EPF-isolat mot senapsbladlöss, vilket gör det möjligt att välja ut potentiella isolat mot olika bladlusarter från ett omfattande EPF-bibliotek. Fältinsamlade bladlöss kan identifieras, och en tillräcklig laboratoriepopulation av senapsbladlöss kan etableras för att utvärdera den afhidicida effekten av olika svampisolat med hjälp av en enkel och genomförbar metod med konsekventa resultat. Bladlöss har utvecklat flera evolutionära mekanismer som svar på intensiva och upprepade antropogena påfrestningar i jordbruksekosystem, vilket innebär utmaningar för livsmedelsförsörjningen9. Därför kan denna beskrivna metod utvidgas till att utvärdera potentiella EPF-isolat mot olika bladlusarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Korsblommiga växter, en grupp grönsaker, angrips ofta av flera bladlusarter, inklusive senapsbladlus (L. erysimi) och kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Båda arterna har rapporterats i Taiwan27, och det är möjligt för dem att samexistera på insamlingsplatsen. För att särskilja närbesläktade bladlusarter användes i denna studie en molekylär identifieringsteknik med hjälp av en multiplex primer set21. Genom att desig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av 109-2313-B-005 -048 -MY3 från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST).
Materials
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
- Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626 (2019).
- Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070 (2022).
- Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144 (2019).
- Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33 (2019).
- Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804 (2021).
- Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
- Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081 (2022).
- Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
- Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
- Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
- Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138 (2022).
- Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
- Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
- Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
- Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
- Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2 (2022).
- Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
- Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
- Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
- Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
- Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882 (2021).
- Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
- Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754 (2019).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
- Liu, T. X., Sparks, A. N. . Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , 9-11 (2001).
- Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
- Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088 (2022).
- Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
- Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
- Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. . 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , (2021).
- Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
- Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).
