Denne protokollen presenterer et optimalisert frittliggende bladbioassay-system for å evaluere effektiviteten av entomopatogene sopp (EPF) mot sennepsbladlusen (Lipaphis erysimi (Kalt.)), et parthenogenetisk insekt. Metoden skisserer datainnsamlingsprosessen under petriskåleksperimenter, slik at forskere konsekvent kan måle virulensen av EPF mot sennepsbladlus og andre parthenogenetiske insekter.
Sennepsbladlusen (L. erysimi) er et som infiserer ulike cruciferous avlinger og overfører plantevirus. For å oppnå miljøvennlig skadedyrsbekjempelse er entomopatogene sopp (EPF) potensielle mikrobielle kontrollmidler for å kontrollere dette. Derfor er virulensscreening av EPF-isolater under petriskålforhold nødvendig før feltpåføring. Imidlertid er sennepsbladlusen et parthenogenetisk insekt, noe som gjør det vanskelig å registrere data under petriskåleksperimenter. Et modifisert system for frittliggende bladbioassays ble utviklet for å løse dette problemet, ved hjelp av en mikrosprøyte for å inokulere konidier på bladlus og forhindre drukning ved å lette lufttørking etter sporesuspensjon. Systemet opprettholdt høy relativ luftfuktighet gjennom hele observasjonsperioden, og bladskiven holdt seg frisk i over ti dager, noe som tillot partenogenetisk reproduksjon av bladlusene. For å forhindre avkomoppbygging ble det gjennomført en prosess med daglig fjerning ved hjelp av en pensel. Denne protokollen demonstrerer et stabilt system for evaluering av virulensen av EPF-isolater mot sennepsbladlus eller andre bladlus, noe som gjør det mulig å velge potensielle isolater for bladluskontroll.
Sennepsbladlusen (L. erysimi) er et beryktet som infiserer en rekke cruciferous avlinger, noe som forårsaker betydelige økonomiske tap1. Mens flere systematiske insektmidler har blitt anbefalt for å bekjempe bladlusangrep, gir hyppig bruk av disse insektmidler bekymringer om plantevernmiddelresistens 2,3. Derfor, når det gjelder miljøvennlig skadedyrsbekjempelse, kan entomopatogene sopp (EPF) tjene som en egnet alternativ kontrollstrategi. EPF er et insektpatogen med evnen til å infisere verter ved å trenge inn i neglebåndene, noe som gjør det til et kraftig middel for å kontrollere bladlus og andre plantesugende insekter4. Videre har EPF vist seg å være en gjennomførbar og bærekraftig skadedyrsbekjempelsesteknikk, og tilbyr fordeler som plantepatogenantagonisme og plantevekstfremmende5.
EPF kan oppnås gjennom insekt-jord baiting eller isolert fra insektkadavre i feltet 6,7. Men før videre bruk av soppisolater, er patogenicitet screening nødvendig. Flere studier har blitt utført på effektiviteten av EPF mot bladlus, som er betydelige som kan forårsake alvorlig skade 8,9. Sennepsbladlus, blant forskjellige arter av bladlus, har blitt testet for følsomhet for flere stammer av Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., og til og med Alternaria, som primært er kjent som en saprofytisk og plantepatogen sopp, men har vist noen dødelige effekter mot sennepsbladlus10,11,12.
For å evaluere effektiviteten av EPF mot bladlus under laboratorieforhold, kan bioassays deles inn i to hoveddeler: inokulasjonskammeret og soppinokulering. Den nåværende protokollen beskriver konstruksjonen av et inokulasjonskammer, hvor bladlus kan opprettholdes ved hjelp av forskjellige metoder som et utskåret blad med en petiole innpakket i fuktig bomull, en utskåret bladskive med en petriskål foret med dempet filterpapir, direkte vedlikehold på potteplanter eller en utskåret bladskive innebygd i vannagar i en petriskål eller beholder10, 11,13. Vanlige metoder for soppinokulering inkluderer conidia-sprøyting, bladlusnedsenking i en conidia-suspensjon, bladdypping i en conidia-suspensjon og planteendofyttinokulering11,14,15,16. Mens ulike inokulasjonsmetoder eksisterer, bør bioassayene simulere feltapplikasjonsforhold. For eksempel, når det gjelder bladdyppet metode12,17, kan effektiviteten av EPF evalueres, men siden bladlusene angriper de soppbelastede bladene, blir den dorsale siden av bladlusen, som er et fortrinnsvis penetrasjonssted, vanligvis ikke utsatt for soppen.
For å evaluere den aphidicide effekten av EPF under laboratorieforhold, foreslår denne protokollen å bruke frittliggende bladmetode beskrevet av Yokomi og Gottwald18 med noen modifikasjoner, etterfulgt av konidia-inokulering ved bruk av en mikrosprøyter. Denne metoden opprettholder omtrent 100% fuktighet i bioassaykammeret i minst syv dager uten å kreve ytterligere etterfylling av vann18,19. I tillegg sikrer begrensning av bladlus til en overflate deres eksponering for conidia-sprøyting og letter observasjoner20. Imidlertid kan bladlus bli sittende fast i den eksponerte agaroverflaten mens de beveger seg i inokulasjonskammeret. Videre kan registrering av data i petriskåleksperimentet med sennepsbladlus, som er parthenogenetiske insekter, være utfordrende på grunn av deres raske utvikling og reproduksjon. Det er vanskelig å skille mellom inokulerte voksne og deres avkom uten fjerning. Detaljene om hvordan du går frem med dette trinnet blir sjelden nevnt, og noen inkonsekvente faktorer, for eksempel bladforbruksområdet, må optimaliseres.
Denne protokollen demonstrerer et stabilt system for screening av virulensen av EPF-isolater mot sennepsbladlus, noe som gjør det mulig å velge potensielle isolater mot forskjellige bladlusarter fra et omfattende EPF-bibliotek. Feltsamlet bladlus kan identifiseres, og en tilstrekkelig laboratoriepopulasjon av sennepsbladlus kan etableres for å evaluere den afhidicide effekten av forskjellige soppisolater ved hjelp av en enkel og gjennomførbar metodikk med konsistente resultater. Bladlus har utviklet flere evolusjonære mekanismer som svar på intenst og gjentatt menneskeskapt press i agroøkosystemer, noe som utgjør utfordringer for matsikkerhet9. Derfor kan denne beskrevne metoden utvides til å evaluere potensielle EPF-isolater mot forskjellige bladlusarter.
Crucifers, en gruppe grønnsaker, er ofte infisert av flere bladlusarter, inkludert sennepsbladlus (L. erysimi) og kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Begge artene er rapportert i Taiwan27, og det er mulig for dem å sameksistere på innsamlingsstedet. For å skille nært beslektede bladlusarter, benyttet denne studien en molekylær identifikasjonsteknikk ved hjelp av et multiplexprimersett21. Ved å designe en molekylær markør…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST).
10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
70% ethanol | |||
9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
Chromas | Technelysium | ||
GeneDoc | |||
GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
Microsprayer | |||
MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
SPSS Statistics | IBM | ||
TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |