Détection électrique cellule-substrat pour l’évaluation en temps réel des profils toxicologiques des structures organométalliques
Summary
L’étude suivante évalue le profil toxicologique d’un cadre métallo-organique sélectionné à l’aide de la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS), une technique de criblage à haut débit en temps réel.
Abstract
Les structures organométalliques (MOF) sont des hybrides formés par la coordination d’ions métalliques et de liants organiques dans des solvants organiques. La mise en œuvre des MOF dans les applications biomédicales et industrielles a suscité des inquiétudes quant à leur sécurité. Ici, le profil d’un MOF sélectionné, un cadre d’imidazole zéolitique, a été évalué lors de l’exposition à des cellules épithéliales pulmonaires humaines. La plate-forme d’évaluation était une technique en temps réel (c’est-à-dire la détection d’impédance cellule-substrat électrique [ECIS]). Cette étude identifie et discute certains des effets délétères du MOF sélectionné sur les cellules exposées. De plus, cette étude démontre les avantages de l’utilisation de la méthode en temps réel par rapport à d’autres tests biochimiques pour des évaluations cellulaires complètes. L’étude conclut que les changements observés dans le comportement cellulaire pourraient faire allusion à une éventuelle toxicité induite lors de l’exposition à des MOF de différentes caractéristiques physico-chimiques et au dosage de ces cadres utilisés. En comprenant les changements dans le comportement des cellules, on entrevoit la possibilité d’améliorer les stratégies de sécurité dès la conception des MOF à utiliser pour des applications biomédicales en adaptant spécifiquement leurs caractéristiques physico-chimiques.
Introduction
Les structures organométalliques (MOF) sont des hybrides formés par la combinaison d’ions métalliques et de liants organiques 1,2 dans des solvants organiques. En raison de la variété de ces combinaisons, les MOF possèdent une diversité structurelle3, une porosité accordable, une stabilité thermique élevée et des surfaces élevées 4,5. De telles caractéristiques en font des candidats attrayants dans une variété d’applications, du stockage de gaz 6,7 à la catalyse8,9, et des agents de contraste 10,11 aux unités d’administration de médicaments12,13. Cependant, la mise en œuvre des MOF dans de telles applications a soulevé des inquiétudes quant à leur sécurité pour les utilisateurs et l’environnement. Des études préliminaires ont montré, par exemple, que la fonction et la croissance cellulaires changent lors de l’exposition des cellules à des ions métalliques ou à des liants utilisés pour la synthèse du MOF 1,14,15. Par exemple, Tamames-Tabar et al. ont démontré que le MOF ZIF-8, un MOF à base de Zn, entraînait davantage de changements cellulaires dans une lignée cellulaire de cancer du col de l’utérus humain (HeLa) et une lignée cellulaire de macrophages de souris (J774) par rapport aux MOF à base de Zr et de Fe. De tels effets étaient vraisemblablement dus au composant métallique de ZIF-8 (c’est-à-dire Zn), qui pourrait potentiellement induire l’apoptose cellulaire lors de la désintégration de la structure et de la libération d’ions Zn1. De même, Gandara-Loe et al. ont démontré que HKUST-1, un MOF à base de Cu, provoquait la plus forte réduction de la viabilité des cellules de rétinoblastome de souris lorsqu’il était utilisé à des concentrations de 10 μg/mL ou plus. Cela était probablement dû à l’ion métallique Cu incorporé lors de la synthèse de cette armature qui, une fois libéré, pouvait induire un stress oxydatif dans les cellules exposées15.
De plus, l’analyse a montré que l’exposition à des MOF ayant des caractéristiques physico-chimiques différentes pouvait entraîner des réponses variables des cellules exposées. Par exemple, Wagner et al. ont démontré que ZIF-8 et MIL-160 (un cadre à base d’Al), utilisés dans l’exposition d’une cellule épithéliale bronchique humaine immortalisée, conduisaient à des réponses cellulaires dépendantes des propriétés physico-chimiques des cadres, à savoir l’hydrophobicité, la taille et les caractéristiques structurelles16. En complément, Chen et al. ont démontré qu’une concentration de 160 μg/mL de MIL-100(Fe) exposée à des cellules hépatiques normales humaines (HL-7702) entraînait la plus grande perte de viabilité cellulaire, probablement en raison de la composante métallique de ce cadre spécifique (c’est-à-dire Fe17).
Bien que ces études classent les effets délétères des MOF sur les systèmes cellulaires en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques et de leurs concentrations d’exposition, soulevant ainsi des préoccupations potentielles quant à la mise en œuvre d’un cadre, en particulier dans les domaines biomédicaux, la plupart de ces évaluations sont basées sur des tests colorimétriques à point temporel unique. Par exemple, il a été démontré que lorsque des dosages de (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure) tétrazolium (MTT) et de sel de tétrazolium soluble dans l’eau (WST-1) étaient utilisés, ces réactifs biochimiques pouvaient conduire à des faux positifs lors de leurs interactions avec les particules auxquelles les cellules étaient également exposées18. Il a été démontré que le sel de tétrazolium et les réactifs rouges neutres possèdent une forte affinité d’adsorption ou de liaison sur les surfaces des particules, ce qui entraîne une interférence du signal de l’agent19. De plus, pour d’autres types de tests, tels que la cytométrie en flux, qui s’est déjà avérée être utilisée pour évaluer les changements dans les cellules exposées aux MOF20,21, il a été démontré que des problèmes majeurs doivent être contournés si l’on veut envisager une analyse viable des effets délétères des particules. En particulier, les plages de détection de la taille des particules, en particulier dans les populations mixtes comme celles offertes par les MOF ou les références des particules utilisées pour l’étalonnage avant les changements cellulaires, doivent être prises en compte22. Il a également été démontré que le colorant utilisé lors du marquage cellulaire pour de tels tests de cytométrie pouvait également interférer avec les nanoparticules auxquelles les cellules étaient exposées23.
L’objectif de cette étude était d’utiliser un test d’évaluation à haut débit en temps réel pour évaluer les changements de comportement des cellules lors de l’exposition à un MOF sélectionné. Les évaluations en temps réel peuvent aider à fournir des informations sur les effets dépendant du temps, en ce qui concerne les fenêtres d’exposition16. De plus, ils fournissent des informations sur les changements dans les interactions cellule-substrat, la morphologie cellulaire et les interactions cellule-cellule, ainsi que sur la façon dont ces changements dépendent des propriétés physico-chimiques des matériaux d’intérêt et des temps d’exposition24,25 respectivement.
Pour démontrer la validité et l’applicabilité de l’approche proposée, des cellules d’épithélium bronchique humain (BEAS-2B), ZIF-8 (un cadre hydrophobe de l’imidazolate zéolitique16) et la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS) ont été utilisées. Les cellules BEAS-2B représentent un modèle d’exposition pulmonaire 26 et ont déjà été utilisées pour évaluer les changements lors de l’exposition des cellules à des nanoargiles et à leurs sous-produits dégradés thermiquement26,27,28, ainsi que pour évaluer la toxicité de nanomatériaux, tels que les nanotubes de carbone à paroi unique (SWCNT)18. De plus, ces cellules sont utilisées depuis plus de 30 ans comme modèle pour la fonction épithéliale pulmonaire29. Le ZIF-8 a été choisi en raison de sa large mise en œuvre dans la catalyse30 et en tant qu’agent de contraste 31 pour la bio-imagerie et l’administration de médicaments32, et donc pour le potentiel accru d’exposition pulmonaire lors de telles applications. Enfin, l’ECIS, la technique non invasive en temps réel, a déjà été utilisée pour évaluer les changements dans l’adhérence, la prolifération, la motilité et la morphologie cellulaires 16,26 à la suite d’une variété d’interactions entre les analytes (matériaux et médicaments) et les cellules exposées en temps réel 16,18,28. ECIS utilise un courant alternatif (AC) pour mesurer l’impédance des cellules immobilisées sur des électrodes en or, les changements d’impédance donnant un aperçu des changements de résistance et de capacité à l’interface cellule-substrat d’or, de la fonction barrière induite par les interactions cellule-cellule et de la couverture de la couche surcellulaire de ces électrodes en or33,34. L’utilisation de l’ECIS permet d’effectuer des mesures quantitatives à l’échelle nanométrique de manière non invasive et en temps réel26,34.
Cette étude évalue et compare la simplicité et la facilité d’évaluation des changements induits par le MOF dans le comportement cellulaire en temps réel avec des évaluations de test en un seul point. Une telle étude pourrait être extrapolée pour évaluer les profils cellulaires en réponse à l’exposition à d’autres particules d’intérêt, permettant ainsi des tests de particules sûrs dès la conception et une aide ultérieure à la mise en œuvre. De plus, cette étude pourrait compléter les tests génétiques et cellulaires qui sont des évaluations en un seul point. Cela pourrait conduire à une analyse plus éclairée des effets délétères des particules sur la population cellulaire et pourrait être utilisé pour cribler la toxicité de ces particules à haut débit16,35,36.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des analyses antérieures ont montré que l’ECIS pouvait être utilisée pour évaluer le comportement des cellules exposées à des analytes (c’est-à-dire des nanotubes de carbone35, des médicaments43 ou des nanoargiles16). De plus, Stueckle et al. ont utilisé l’ECIS pour évaluer la toxicité des cellules BEAS-2B exposées à des nanoargiles et à leurs sous-produits et ont constaté que le comportement cellulaire et l’attachement dépen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés en partie par le programme T32 (T32 GM133369) de l’Institut national des sciences médicales générales (NIGMS) et la National Science Foundation (NSF 1454230). De plus, l’aide et le soutien des installations de recherche partagées de la WVU et de la biophysique appliquée sont reconnus.
Materials
| 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay) | Roche | 5015944001 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25255-056 | |
| 100 mm plates | Corning | 430167 | |
| 1300 Series A2 biofume hood | Thermo Scientific | 323TS | |
| 2510 Branson bath sonicator | Process Equipment & Supply, Inc. | 251OR-DTH | |
| 2-methylimidazole, 97% | Alfa Aesar | 693-98-1 | |
| 5 mL sterile microtube | Argos Technologies | T2076S-CA | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| 96W10idf well plates | Applied Biophysics | 96W10idf PET | |
| 96-well plates | Fisherbrand | FB012931 | |
| Biorender | Biorender | N/A | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II FL automated cell counter | Life Technologies | C0916-186A-0303 | |
| Denton Desk V sputter and carbon coater | Denton Vacuum | N/A | |
| Dimethly sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| DPBS/Modified | Cytiva | SH30028.02 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium | Corning | 10-014-CV | |
| ECIS-ZΘ | Applied Biophysics | ABP 1129 | |
| Excel | Microsoft | Version 2301 | |
| Falcon tubes (15 mL) | Corning | 352196 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16140-071 | |
| FLUOstar OPTIMA plate reader | BMG LABTECH | 413-2132 | |
| GraphPad Prism Software (9.0.0) | GraphPad Software, LLC | Version 9.0.0 | |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116047 | |
| Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray | Hitachi High-Technologies Corporation | S4700 and EDAX TEAM analysis software | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Immortalized human bronchial epithelial cells | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Isotemp freezer | Fisher Scientific | ||
| Methanol, 99% | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Parafilm sealing film | The Lab Depot | HS234526A | |
| Penicillin/Steptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004220 | |
| Sorvall T 6000B | DU PONT | T6000B | |
| Trypan blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals, LLC | 1691049 | |
| Vacuum Chamber | Belart | 999320237 | |
| Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure | Acros Organic | 101-96-18-9 |
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