Rilevamento elettrico cellula-substrato per la valutazione in tempo reale dei profili tossicologici della struttura metallo-organica
Summary
Il seguente studio valuta il profilo tossicologico di una struttura metallo-organica selezionata utilizzando il rilevamento dell’impedenza della cellula-substrato elettrico (ECIS), una tecnica di screening in tempo reale e ad alto rendimento.
Abstract
Le strutture metallo-organiche (MOF) sono ibridi formati attraverso la coordinazione di ioni metallici e leganti organici in solventi organici. L’implementazione dei MOF in applicazioni biomediche e industriali ha sollevato preoccupazioni per quanto riguarda la loro sicurezza. In questo caso, il profilo di un MOF selezionato, una struttura zeolitica imidazolica, è stato valutato dopo l’esposizione a cellule epiteliali polmonari umane. La piattaforma per la valutazione era una tecnica in tempo reale (ad esempio, il rilevamento dell’impedenza della cella elettrica-substrato [ECIS]). Questo studio identifica e discute alcuni degli effetti deleteri del MOF selezionato sulle cellule esposte. Inoltre, questo studio dimostra i vantaggi dell’utilizzo del metodo in tempo reale rispetto ad altri saggi biochimici per valutazioni cellulari complete. Lo studio conclude che i cambiamenti osservati nel comportamento cellulare potrebbero suggerire una possibile tossicità indotta dall’esposizione a MOF di diverse caratteristiche fisico-chimiche e dal dosaggio di tali strutture utilizzate. Comprendendo i cambiamenti nel comportamento cellulare, si prevede la capacità di migliorare le strategie di sicurezza fin dalla progettazione dei MOF da utilizzare per applicazioni biomediche, adattando in modo specifico le loro caratteristiche fisico-chimiche.
Introduction
Le strutture metallo-organiche (MOF) sono ibridi formati attraverso la combinazione di ioni metallici e linker organici 1,2 in solventi organici. A causa della varietà di tali combinazioni, i MOF possiedono diversità strutturale3, porosità regolabile, elevata stabilità termica ed elevate aree superficiali 4,5. Tali caratteristiche li rendono candidati interessanti in una varietà di applicazioni, dallo stoccaggio di gas 6,7 alla catalisi8,9, e dai mezzi di contrasto 10,11 alle unità di somministrazione di farmaci 12,13. Tuttavia, l’implementazione dei MOF in tali applicazioni ha sollevato preoccupazioni relative alla loro sicurezza sia per gli utenti che per l’ambiente. Studi preliminari hanno dimostrato, ad esempio, che la funzione cellulare e la crescita cambiano in seguito all’esposizione delle cellule a ioni metallici o linker utilizzati per la sintesi di MOF 1,14,15. Ad esempio, Tamames-Tabar et al. hanno dimostrato che ZIF-8 MOF, un MOF a base di Zn, stava portando a più cambiamenti cellulari in una linea cellulare di cancro cervicale umano (HeLa) e in una linea cellulare di macrofagi di topo (J774) rispetto ai MOF a base di Zr e Fe. Tali effetti erano presumibilmente dovuti alla componente metallica di ZIF-8 (cioè Zn), che potrebbe potenzialmente indurre l’apoptosi cellulare dopo la disintegrazione della struttura e il rilascio di ioni Zn1. Allo stesso modo, Gandara-Loe et al. hanno dimostrato che HKUST-1, un MOF a base di Cu, ha causato la più alta riduzione della vitalità delle cellule di retinoblastoma di topo quando usato a concentrazioni di 10 μg/mL o superiori. Ciò era presumibilmente dovuto allo ione metallico Cu incorporato durante la sintesi di questa struttura, che, una volta rilasciato, poteva indurre stress ossidativo nelle cellule esposte15.
Inoltre, l’analisi ha dimostrato che l’esposizione a MOF con diverse caratteristiche fisico-chimiche potrebbe portare a risposte diverse delle cellule esposte. Ad esempio, Wagner et al. hanno dimostrato che ZIF-8 e MIL-160 (una struttura a base di Al), utilizzati nell’esposizione di una cellula epiteliale bronchiale umana immortalizzata, hanno portato a risposte cellulari dipendenti dalle proprietà fisico-chimiche delle strutture, vale a dire idrofobicità, dimensioni e caratteristiche strutturali16. Parallelamente, Chen et al. hanno dimostrato che una concentrazione di 160 μg/mL MIL-100(Fe) esposta a cellule epatiche umane normali (HL-7702) ha causato la maggiore perdita di vitalità cellulare, presumibilmente a causa della componente metallica di questa specifica struttura (cioè Fe17).
Mentre questi studi classificano gli effetti deleteri dei MOF sui sistemi cellulari in base alle loro caratteristiche fisico-chimiche e alle concentrazioni di esposizione, sollevando così potenziali preoccupazioni con l’implementazione del quadro, specialmente in campo biomedico, la maggior parte di queste valutazioni si basa su saggi colorimetrici a singolo punto temporale. Ad esempio, è stato dimostrato che quando sono stati utilizzati saggi di tetrazolio (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) e sale di tetrazolio solubile in acqua (WST-1), questi reagenti biochimici potrebbero portare a falsi positivi nelle loro interazioni con le particelle a cui le cellule sono state esposte18. È stato dimostrato che il sale di tetrazolio e i reagenti rossi neutri possiedono un’elevata affinità di adsorbimento o legame sulle superfici delle particelle, con conseguente interferenza del segnale dell’agente19. Inoltre, per altri tipi di saggi, come la citometria a flusso, che in precedenza si era dimostrata utilizzata per valutare i cambiamenti nelle cellule esposte ai MOF20,21, è stato dimostrato che i principali problemi devono essere aggirati se si vuole prendere in considerazione un’analisi praticabile degli effetti deleteri delle particelle. In particolare, devono essere affrontati gli intervalli di rivelazione delle dimensioni delle particelle, specialmente in popolazioni miste come quelle offerte dai MOF o i riferimenti delle particelle utilizzate per la calibrazione prima dei cambiamenti cellulari22. È stato anche dimostrato che il colorante utilizzato durante la marcatura cellulare per tali saggi citometrici potrebbe anche interferire con le nanoparticelle a cui le cellule sono state esposte23.
L’obiettivo di questo studio era quello di utilizzare un saggio di valutazione in tempo reale e ad alto rendimento per valutare i cambiamenti nel comportamento cellulare in seguito all’esposizione a un MOF selezionato. Le valutazioni in tempo reale possono aiutare a fornire informazioni sugli effetti dipendenti dal tempo, in relazione alle finestre di esposizione16. Inoltre, forniscono informazioni sui cambiamenti nelle interazioni cellula-substrato, sulla morfologia cellulare e sulle interazioni cellula-cellula, nonché su come tali cambiamenti dipendano rispettivamente dalle proprietà fisico-chimiche dei materiali di interesse e dai tempi di esposizione24,25.
Per dimostrare la validità e l’applicabilità dell’approccio proposto, sono state utilizzate cellule epiteliali bronchiali umane (BEAS-2B), ZIF-8 (una struttura idrofobica di imidazolatozeolitico 16) e rilevamento dell’impedenza cellula-substrato elettrico (ECIS). Le cellule BEAS-2B rappresentano un modello per l’esposizione polmonare 26 e sono state precedentemente utilizzate per valutare i cambiamenti in seguito all’esposizione delle cellule alle nanoargille e ai loro sottoprodotti degradati termicamente26,27,28, nonché per valutare la tossicità dei nanomateriali, come i nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT)18. Inoltre, tali cellule sono state utilizzate per più di 30 anni come modello per la funzione epiteliale polmonare29. ZIF-8 è stato scelto per la sua ampia implementazione nella catalisi30 e come mezzo di contrasto31 per il bioimaging e la somministrazione di farmaci32, e quindi per l’esteso potenziale di esposizione polmonare durante tali applicazioni. Infine, ECIS, la tecnica non invasiva in tempo reale, è stata precedentemente utilizzata per valutare i cambiamenti nell’aderenza, nella proliferazione, nella motilità e nella morfologia cellulare 16,26 come risultato di una varietà di interazioni tra analiti (sia materiali che farmaci) e cellule esposte in tempo reale 16,18,28. ECIS utilizza una corrente alternata (AC) per misurare l’impedenza delle celle immobilizzate sugli elettrodi d’oro, con le variazioni di impedenza che forniscono informazioni sui cambiamenti di resistenza e capacità all’interfaccia del substrato cellula-oro, sulla funzione di barriera indotta dalle interazioni cellula-cellula e sulla copertura dello strato sovracellulare di tali elettrodi d’oro33,34. L’utilizzo di ECIS consente misurazioni quantitative con una risoluzione su scala nanometrica in modo non invasivo e in tempo reale26,34.
Questo studio valuta e confronta la semplicità e la facilità di valutazione dei cambiamenti indotti da MOF nel comportamento cellulare in tempo reale con le valutazioni dei saggi a punto singolo. Tale studio potrebbe essere ulteriormente estrapolato per valutare i profili cellulari in risposta all’esposizione ad altre particelle di interesse, consentendo così test delle particelle sicuri fin dalla progettazione e il successivo aiuto per l’implementazione. Inoltre, questo studio potrebbe integrare i saggi genetici e cellulari che sono valutazioni a punto singolo. Ciò potrebbe portare a un’analisi più informata degli effetti deleteri delle particelle sulla popolazione cellulare e potrebbe essere utilizzato per lo screening della tossicità di tali particelle in modo ad alto rendimento16,35,36.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analisi precedenti hanno mostrato che l’ECIS potrebbe essere utilizzato per valutare il comportamento delle cellule esposte agli analiti (ad esempio, nanotubi di carbonio35, farmaci43 o nanoargille16). Inoltre, Stueckle et al. hanno utilizzato ECIS per valutare la tossicità delle cellule BEAS-2B esposte alle nanoargille e ai loro sottoprodotti e hanno scoperto che il comportamento cellulare e l’attaccamento dipendevano dalle caratteristiche fisico-c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato in parte dal programma T32 del National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (T32 GM133369) e dalla National Science Foundation (NSF 1454230). Inoltre, vengono riconosciute le strutture di ricerca condivise della WVU e l’assistenza e il supporto di biofisica applicata.
Materials
| 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay) | Roche | 5015944001 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25255-056 | |
| 100 mm plates | Corning | 430167 | |
| 1300 Series A2 biofume hood | Thermo Scientific | 323TS | |
| 2510 Branson bath sonicator | Process Equipment & Supply, Inc. | 251OR-DTH | |
| 2-methylimidazole, 97% | Alfa Aesar | 693-98-1 | |
| 5 mL sterile microtube | Argos Technologies | T2076S-CA | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| 96W10idf well plates | Applied Biophysics | 96W10idf PET | |
| 96-well plates | Fisherbrand | FB012931 | |
| Biorender | Biorender | N/A | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess II FL automated cell counter | Life Technologies | C0916-186A-0303 | |
| Denton Desk V sputter and carbon coater | Denton Vacuum | N/A | |
| Dimethly sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| DPBS/Modified | Cytiva | SH30028.02 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium | Corning | 10-014-CV | |
| ECIS-ZΘ | Applied Biophysics | ABP 1129 | |
| Excel | Microsoft | Version 2301 | |
| Falcon tubes (15 mL) | Corning | 352196 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16140-071 | |
| FLUOstar OPTIMA plate reader | BMG LABTECH | 413-2132 | |
| GraphPad Prism Software (9.0.0) | GraphPad Software, LLC | Version 9.0.0 | |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116047 | |
| Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray | Hitachi High-Technologies Corporation | S4700 and EDAX TEAM analysis software | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N/A | |
| Immortalized human bronchial epithelial cells | American Type Culture Collection | CRL-9609 | |
| Isotemp freezer | Fisher Scientific | ||
| Methanol, 99% | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Parafilm sealing film | The Lab Depot | HS234526A | |
| Penicillin/Steptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004220 | |
| Sorvall T 6000B | DU PONT | T6000B | |
| Trypan blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals, LLC | 1691049 | |
| Vacuum Chamber | Belart | 999320237 | |
| Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure | Acros Organic | 101-96-18-9 |
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