Elektrisk cell-substratavkänning för realtidsutvärdering av metallorganiska toxikologiska ramverk

Summary

Följande studie utvärderar den toxikologiska profilen för ett utvalt metallorganiskt ramverk med hjälp av elektrisk cell-substrat impedansavkänning (ECIS), en screeningteknik med hög genomströmning i realtid.

Abstract

Metallorganiska ramverk (MOFs) är hybrider som bildas genom samordning av metalljoner och organiska bindare i organiska lösningsmedel. Implementeringen av MOFs i biomedicinska och industriella tillämpningar har lett till oro för deras säkerhet. Häri utvärderades profilen för en utvald MOF, ett zeolitiskt imidasolramverk, vid exponering för humana lungepitelceller. Plattformen för utvärdering var en realtidsteknik (dvs. elektrisk cell-substrat impedansavkänning [ECIS]). Denna studie identifierar och diskuterar några av de skadliga effekterna av den valda MOF på de exponerade cellerna. Dessutom visar denna studie fördelarna med att använda realtidsmetoden jämfört med andra biokemiska analyser för omfattande cellutvärderingar. Studiens slutsats är att observerade förändringar i cellbeteende kan antyda möjlig toxicitet inducerad vid exponering för MOFs med olika fysikalisk-kemiska egenskaper och doseringen av de ramverk som används. Genom att förstå förändringar i cellbeteende förutser man möjligheten att förbättra safe-by-design-strategier för MOFs som ska användas för biomedicinska tillämpningar genom att specifikt skräddarsy deras fysikalisk-kemiska egenskaper.

Introduction

Metallorganiska ramverk (MOFs) är hybrider som bildas genom kombinationen av metalljoner och organiska länkar ^1,2 i organiska lösningsmedel. På grund av mångfalden av sådana kombinationer har MOFs strukturell mångfald³, avstämbar porositet, hög termisk stabilitet och höga ytytor ^4,5. Sådana egenskaper gör dem till attraktiva kandidater i en mängd olika tillämpningar, från gaslagring ^6,7 till katalys^8,9 och från kontrastmedel 10,11 till läkemedelsleveransenheter ^12,13. Implementeringen av MOFs i sådana applikationer har dock väckt farhågor om deras säkerhet för både användarna och miljön. Preliminära studier har till exempel visat att cellulär funktion och tillväxt förändras när celler exponeras för metalljoner eller länkar som används för MOF-syntes 1,14,15. Till exempel visade Tamames-Tabar et al. att ZIF-8 MOF, en Zn-baserad MOF, ledde till fler cellulära förändringar i en human livmoderhalscancercellinje (HeLa) och en musmakrofagcellinje (J774) i förhållande till Zr-baserade och Fe-baserade MOFs. Sådana effekter berodde förmodligen på metallkomponenten i ZIF-8 (dvs. Zn), som potentiellt kan inducera cellapoptos vid ramverkssönderfall och Zn-jonfrisättning¹. På liknande sätt visade Gandara-Loe et al. att HKUST-1, en Cu-baserad MOF, orsakade den högsta minskningen av musretinoblastomcellviabilitet när den användes i koncentrationer på 10 μg/ml eller mer. Detta berodde förmodligen på att Cu-metalljonen inkorporerades under syntesen av detta ramverk, som, när den väl frigjordes, kunde inducera oxidativ stress i de exponerade cellerna¹⁵.

Dessutom visade analyser att exponering för MOFs med olika fysikalisk-kemiska egenskaper kunde leda till varierande respons hos exponerade celler. Till exempel visade Wagner et al. att ZIF-8 och MIL-160 (ett Al-baserat ramverk), som användes vid exponering av en odödliggjord human bronkialepitelcell, ledde till cellulära svar beroende på ramverkets fysikalisk-kemiska egenskaper, nämligen hydrofobicitet, storlek och strukturella egenskaper¹⁶. Som komplement visade Chen et al. att en koncentration av 160 μg/ml MIL-100(Fe) som exponerades för humana normala leverceller (HL-7702) orsakade den största förlusten av cellulär viabilitet, förmodligen på grund av metallkomponenten i detta specifika ramverk (dvs. Fe¹⁷).

Även om dessa studier kategoriserar MOFs skadliga effekter på cellulära system baserat på deras fysikalisk-kemiska egenskaper och exponeringskoncentrationer, vilket ger upphov till potentiella problem med ramimplementering, särskilt inom biomedicinska områden, är de flesta av dessa utvärderingar baserade på kolorimetriska analyser vid en tidpunkt. Till exempel visades det att när (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) tetrazolium (MTT) och vattenlösligt tetrazoliumsalt (WST-1) användes kunde dessa biokemiska reagenser leda till falskt positiva resultat vid deras interaktioner med de partiklar som cellerna också exponerades för¹⁸. Tetrazoliumsaltet och de neutrala röda reagenserna visade sig ha en hög adsorption eller bindningsaffinitet på partiklarnas ytor, vilket resulterade i signalinterferens¹⁹. För andra typer av analyser, såsom flödescytometri, som tidigare visat sig användas för att bedöma förändringar i celler som exponerats för MOFs^20,21, visade det sig att stora problem måste kringgås om en genomförbar analys av partiklars skadliga effekter ska övervägas. I synnerhet måste detektionsområden för partiklarnas storlek, särskilt i blandade populationer som de som erbjuds av MOFs eller referenser till de partiklar som används för kalibrering före cellulära förändringar, tas upp²². Det visade sig också att färgämnet som användes vid cellmärkning för sådana cytometrianalyser också kunde störa de nanopartiklar som cellerna^{utsattes för.}

Målet med denna studie var att använda en utvärderingsanalys i realtid med hög genomströmning för att bedöma förändringar i cellbeteende vid exponering för en utvald MOF. Utvärderingar i realtid kan bidra till att ge insikter om tidsberoende effekter, i förhållande till exponeringsfönstren¹⁶. Vidare ger de information om förändringar i cell-substratinteraktioner, cellmorfologi och cell-cellinteraktioner, samt hur sådana förändringar beror på de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos materialen av intresse respektive exponeringsgånger^24,25.

För att demonstrera giltigheten och tillämpligheten av det föreslagna tillvägagångssättet användes humana bronkialepitelceller (BEAS-2B), ZIF-8 (ett hydrofobt ramverk av zeolitisk imidazolat¹⁶) och elektrisk cell-substratimpedansavkänning (ECIS). BEAS-2B-celler utgör en modell för lungexponering 26 och har tidigare använts för att utvärdera förändringar vid exponering av celler för nanolera och deras termiskt nedbrutna biprodukter^26,27,28, samt för att bedöma toxiciteten hos nanomaterial^, såsom enkelväggiga kolnanorör (SWCNT)¹⁸. Dessutom har sådana celler använts i mer än 30 år som modell för lungepitelfunktion²⁹. ZIF-8 valdes på grund av dess breda implementering i katalys³⁰ och som kontrastmedel 31 för bioimaging och läkemedelstillförsel³², och därmed för den utökade potentialen för lungexponering under sådana applikationer. Slutligen har ECIS, den icke-invasiva realtidstekniken, tidigare använts för att utvärdera förändringar i cellvidhäftning, proliferation, motilitet och morfologi 16,26 som ett resultat av en mängd olika interaktioner mellan analyter (både material och läkemedel) och exponerade celler i realtid ^16,18,28. ECIS använder en växelström (AC) för att mäta impedansen hos celler som är immobiliserade på guldelektroder, där impedansförändringarna ger insikter om förändringar i resistans och kapacitans vid cell-guldsubstratgränssnittet, barriärfunktion som induceras av cell-cellinteraktioner och täckning över cellskiktet av sådana guldelektroder^33,34. Genom att använda ECIS kan kvantitativa mätningar med nanoupplösning på ett icke-invasivt sätt i realtid^26,34.

Denna studie bedömer och jämför enkelheten och lättheten att utvärdera MOF-inducerade förändringar i cellulärt beteende i realtid med enpunktsanalysutvärderingar. En sådan studie skulle kunna extrapoleras ytterligare för att utvärdera cellprofiler som svar på exponering för andra partiklar av intresse, vilket skulle möjliggöra testning av partiklar med säker design och därefter hjälpa till med genomförandet. Dessutom kan denna studie komplettera genetiska och cellulära analyser som är enpunktsutvärderingar. Detta skulle kunna leda till en mer informerad analys av partiklarnas skadliga effekter på den cellulära populationen och skulle kunna användas för att screena sådana partiklars toxicitet på ett sätt med hög genomströmning^16,35,36.

Protocol

1. ZIF-8-syntes I det här exemplet använder du ett massförhållande på 1:10:100 (metall:länkare:lösningsmedel) för att syntetisera ZIF-8. För detta, mät upp zinknitrathexahydrat och registrera mätningen. Använd exemplet på massförhållande för att beräkna den mängd som behövs för länkaren, 2-metylimidazol och lösningsmedlet (dvs. metanol). Placera zinknitrathexahydratet och linkern i två olika glasflaskor. Tillsätt hälften av den beräknade mängden metanol till…

Representative Results

Med hjälp av en vanlig in vitro-modellcellinje39 (BEAS-2B) syftade denna studie till att visa genomförbarheten och tillämpligheten av ECIS för att bedöma förändringar i cellbeteende vid exponering för en laboratoriesyntetiserad MOF. Bedömningen av dessa förändringar kompletterades med analys genom konventionella kolorimetriska analyser. Ramverkets fysikalisk-kemiska egenskaper utvärderades först för att säkerställa reproducerbarheten av de anvä…

Discussion

Tidigare analyser visade att ECIS kunde användas för att bedöma beteendet hos celler som exponerats för analyter (dvs. kolnanorör³⁵, läkemedel⁴³ eller nanoleror¹⁶). Dessutom använde Stueckle et al. ECIS för att utvärdera toxiciteten hos BEAS-2B-celler som exponerats för nanoleror och deras biprodukter och fann att cellulärt beteende och bindning var beroende av de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos sådana material^42</su…

Materials

4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)	Roche	5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25255-056
100 mm plates	Corning	430167
1300 Series A2 biofume hood	Thermo Scientific	323TS
2510 Branson bath sonicator	Process Equipment & Supply, Inc.	251OR-DTH
2-methylimidazole, 97%	Alfa Aesar	693-98-1
5 mL sterile microtube	Argos Technologies	T2076S-CA
50 mL  tubes	Falcon	352098
96W10idf well plates	Applied Biophysics	96W10idf PET
96-well plates	Fisherbrand	FB012931
Biorender	Biorender	N/A
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess II FL automated cell counter	Life Technologies	C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater	Denton Vacuum	N/A
Dimethly sulfoxide	Corning	25-950-CQC
DPBS/Modified	Cytiva	SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium	Corning	10-014-CV
ECIS-ZΘ	Applied Biophysics	ABP 1129
Excel	Microsoft	Version 2301
Falcon tubes (15 mL)	Corning	352196
Fetal bovine serum	Gibco	16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader	BMG LABTECH	413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)	GraphPad Software, LLC	Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray	Hitachi High-Technologies Corporation	S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells	American Type Culture Collection	CRL-9609
Isotemp freezer	Fisher Scientific
Methanol, 99%	Fisher Chemical	67-56-1
Parafilm sealing film	The Lab Depot	HS234526A
Penicillin/Steptomycin	Gibco	15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermo Scientific	75004220
Sorvall T 6000B	DU PONT	T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals, LLC	1691049
Vacuum Chamber	Belart	999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure	Acros Organic	101-96-18-9