حقن داخل المخ البطيني الحر في الفئران
Summary
هنا ، يتم وصف نهج بسيط وسريع لأداء الحقن داخل بطانة الرحم البطينية في الفئران باستخدام نهج اليد الحرة (أي بدون جهاز مجسم).
Abstract
غالبا ما يتطلب فحص أنظمة الغدد الصم العصبية توصيل الأدوية أو الفيروسات أو العوامل التجريبية الأخرى مباشرة إلى أدمغة الفئران. يسمح الحقن داخل بطانة الرحم البطينية (ICV) بتوصيل العامل التجريبي على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ (خاصة في الهياكل القريبة من البطينين). هنا ، يتم وصف طرق إجراء حقن ICV اليد في الفئران البالغة. باستخدام المعالم البصرية واللمسية على رؤوس الفئران ، يمكن إجراء الحقن في البطينين الجانبيين بسرعة وموثوقية. يتم إجراء الحقن باستخدام حقنة زجاجية مثبتة في يد المجرب وتوضع على مسافات تقريبية من المعالم. وبالتالي ، فإن هذه التقنية لا تتطلب إطارا مجسما. علاوة على ذلك ، لا تتطلب هذه التقنية سوى تخدير إيزوفلوران قصير ، مما يسمح بالتقييم اللاحق لسلوك الفئران و / أو علم وظائف الأعضاء في الفئران المستيقظة التي تتصرف بحرية. يعد حقن القيمة المحلية الحر أداة قوية للتوصيل الفعال للعوامل التجريبية إلى أدمغة الفئران الحية ويمكن دمجه مع تقنيات أخرى مثل أخذ عينات الدم بشكل متكرر أو التلاعب بالدوائر العصبية أو التسجيل في الجسم الحي للتحقيق في عمليات الغدد الصم العصبية.
Introduction
غالبا ما يكون توصيل العوامل التجريبية ، مثل الأدوية1 أو الفيروسات2 أو الخلايا3 ، إلى الدماغ ضروريا لأبحاث الغدد الصم العصبية. إذا كان العامل لا يعبر بسهولة الحاجز الدموي الدماغي أو كان الهدف التجريبي هو اختبار التأثيرات المركزية للعامل على وجه التحديد ، فمن المهم أن يكون لديك طريقة موثوقة لتوصيل الحقن إلى الدماغ. علاوة على ذلك ، يوفر الحقن في الفضاء داخل المخ البطيني (ICV) الفرصة لتوزيع العامل على نطاق واسع في الدماغ ويوفر منطقة مستهدفة كبيرة ، مما يزيد من احتمال نجاح الحقن2.
تتضمن الطريقة الشائعة لصنع حقن القيمة المحلية وضع قنية دائمة في الداخل. في هذا النهج ، يعد الإطار التجسيمي ضروريا لوضع القنية المتاحة تجاريا أو المصنوعة حسب الطلب ، حيث يتم لصق القنية أو تثبيتها في مكانها. في كثير من الأحيان ، عند الشفاء ، يتم إعطاء جرعة فوق فسيولوجية من الأنجيوتنسين II من خلال القنية ، وإذا لوحظ سلوك الشرب على الفور ، اعتبار القنية موضوعة بشكل صحيح4. هذا النهج له العديد من المزايا ، بما في ذلك القدرة على إجراء التسريب على المدى الطويل والقدرة على حقن نفس عدة مرات. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم استخدام الأنجيوتنسين II ، يمكن تأكيد الموضع الصحيح قبل إعطاء المركبات التجريبية. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على وضع قنية دائمة ، بما في ذلك الحاجة إلى معدات باهظة الثمن (إطار مجسم) ، وإمكانية تلف القنية بعد وضعها (على سبيل المثال ، يمكن للفئران مضغ قنية رفيقة القفص) ، وإمكانية حدوث عدوى حول القنية الدائمة. يمكن إجراء حقن ICV واحدة باستخدام إطار تجسيمي3 ، والذي ، على الرغم من فعاليته ، يتطلب تعرضا كبيرا للتخدير ، وبالتالي قد يحجب بعض الآثار الفسيولوجية والسلوكية الحادة للعلاج. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب وضع الفئران في إطار تجسيمي تدريبا كبيرا لتحقيق وضع مستقر ومنع تمزق قنوات الأذن.
هنا ، يتم وصف طريقة ثابتة لإجراء حقن اليد الحرة في الفئران. تعتمد هذه الطريقة على التقارير السابقة 5,6. تتمثل مزايا هذه التقنية في أنها بسيطة وسريعة ولا تتطلب معدات متخصصة مثل الإطار المجسم. كما هو موضح أدناه ، يتضمن هذا الإجراء معالجة حقنة زجاجية بالنسبة للمعالم الموجودة على رأس الماوس لإجراء الحقن ، والتي يمكن إجراؤها بسرعة ، وبالتالي لا تتطلب سوى بضع دقائق من التخدير بالغاز في اليوم التجريبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم وصف وسيلة بسيطة وفعالة لإجراء حقن ICV في الفئران. نظرا لأن هذه التقنية لا تتطلب إطارا مجسما ، فإن هذا النهج للتوصيل المركزي للأدوية والعوامل التجريبية متاح لمزيد من الباحثين. بالإضافة إلى ذلك ، يعد هذا النهج إنتاجية عالية نسبيا حيث يمكن إجراء التحضير والحقن بسرعة.
ن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتورة كيلي برين تشيرش والسيد مايكل كريسمان والسيدة جيسيكا جانغ على مساهماتهم في جمع البيانات المبينة في النتائج التمثيلية. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
