Intracerebroventriculaire injecties uit de vrije hand bij muizen
Summary
Hier wordt een eenvoudige en snelle aanpak beschreven voor het uitvoeren van intracerebroventriculaire injecties bij muizen met behulp van een benadering uit de vrije hand (dat wil zeggen zonder stereotaxisch apparaat).
Abstract
Het onderzoek van neuro-endocriene systemen vereist vaak de toediening van medicijnen, virussen of andere experimentele middelen rechtstreeks in de hersenen van muizen. Een intracerebroventriculaire (ICV) injectie maakt de wijdverspreide afgifte van het experimentele middel door de hersenen mogelijk (met name in de structuren nabij de ventrikels). Hier worden methoden beschreven voor het maken van ICV-injecties uit de vrije hand bij volwassen muizen. Door gebruik te maken van visuele en tactiele oriëntatiepunten op de hoofden van muizen, kunnen injecties in de laterale ventrikels snel en betrouwbaar worden uitgevoerd. De injecties worden toegediend met een glazen spuit die in de hand van de onderzoeker wordt gehouden en op ongeveer afstand van de oriëntatiepunten wordt geplaatst. Voor deze techniek is dus geen stereotaxisch frame nodig. Bovendien vereist deze techniek slechts een korte isofluraananesthesie, waardoor het gedrag en/of de fysiologie van muizen bij wakkere, zich vrij gedragende muizen achteraf kunnen worden beoordeeld. ICV-injectie uit de vrije hand is een krachtig hulpmiddel voor de efficiënte afgifte van experimentele middelen in de hersenen van levende muizen en kan worden gecombineerd met andere technieken zoals frequente bloedafname, neurale circuitmanipulatie of in vivo opname om neuro-endocriene processen te onderzoeken.
Introduction
De afgifte van experimentele middelen, zoals geneesmiddelen1, virussen2 of cellen3, aan de hersenen is vaak nodig voor neuro-endocrien onderzoek. Als het middel niet gemakkelijk de bloed-hersenbarrière passeert of als het experimentele doel is om specifiek de centrale effecten van het middel te testen, is het belangrijk om een betrouwbare methode te hebben voor het toedienen van injecties in de hersenen. Bovendien biedt injectie in de intracerebroventriculaire (ICV) ruimte de mogelijkheid om het middel op grote schaal in de hersenen te verspreiden en biedt het een groot doelgebied, waardoor de kans op een succesvolle injectie toeneemt2.
Een veelgebruikte methode voor het maken van ICV-injecties is het plaatsen van een permanente verblijfscanule. Bij deze aanpak is een stereotaxisch frame nodig om de in de handel verkrijgbare of op maat gemaakte canule te positioneren, aangezien de canule op zijn plaats wordt gelijmd of gecementeerd. Vaak wordt bij herstel een suprafysiologische dosis angiotensine II via de canule toegediend en als het drinkgedrag onmiddellijk wordt waargenomen, wordt de canule als correct geplaatstbeschouwd 4. Deze aanpak heeft veel voordelen, waaronder de mogelijkheid om langdurige infusie uit te voeren en de mogelijkheid om hetzelfde dier meerdere keren te injecteren; bovendien, als angiotensine II wordt gebruikt, kan de juiste plaatsing worden bevestigd voorafgaand aan de toediening van experimentele verbindingen. Er zijn echter enkele beperkingen aan het plaatsen van een permanente canule, waaronder de vereiste voor dure apparatuur (stereotaxisch frame), de mogelijkheid van beschadiging van de canule na plaatsing (muizen kunnen bijvoorbeeld op de canule van een kooigenoot kauwen) en de mogelijkheid van infecties rond de permanente canule. Enkelvoudige ICV-injecties kunnen worden gemaakt met behulp van een stereotaxisch frame3, dat, hoewel effectief, aanzienlijke blootstelling aan anesthesie vereist en dus enkele acute fysiologische en gedragseffecten van de behandeling kan verdoezelen. Bovendien vereist de plaatsing van muizen in een stereotaxisch frame een aanzienlijke training om een stabiele plaatsing te bereiken en het scheuren van de gehoorgangen te voorkomen.
Hier wordt een gevestigde methode beschreven voor het maken van injecties uit de vrije hand bij muizen. Deze methode is gebaseerd op eerdere rapporten 5,6. De voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig en snel is en dat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is, zoals een stereotaxisch frame. Zoals hieronder beschreven, omvat deze procedure het manipuleren van een glazen spuit ten opzichte van oriëntatiepunten op het hoofd van de muis om de injecties uit te voeren, wat snel kan worden gedaan en dus slechts enkele minuten gasanesthesie op de experimentele dag vereist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een eenvoudige en effectieve manier beschreven voor het maken van ICV-injecties bij muizen. Aangezien deze techniek geen stereotaxisch frame vereist, is deze aanpak voor de centrale toediening van medicijnen en experimentele middelen toegankelijk voor meer onderzoekers. Bovendien heeft deze aanpak een relatief hoge doorvoer, omdat de voorbereidings- en injectieprocedure snel kan worden uitgevoerd.
Aangezien deze procedure de manipulatie van naalden en een glazen spuit met de hand ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Kellie Breen Church, de heer Michael Kreisman en mevrouw Jessica Jang bedanken voor hun bijdragen aan het verzamelen van de gegevens die in de representatieve resultaten worden getoond. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (RBM).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
