זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים
Summary
כאן מתוארת גישה פשוטה ומהירה לביצוע הזרקות תוך-מוחיות בעכברים בגישה של יד חופשית (כלומר, ללא מכשיר סטריאוטקסי).
Abstract
חקירת מערכות נוירואנדוקריניות דורשת לעתים קרובות העברה של תרופות, וירוסים או חומרים ניסיוניים אחרים ישירות למוחם של עכברים. הזרקה תוך-מוחית (ICV) מאפשרת העברה נרחבת של חומר הניסוי ברחבי המוח (במיוחד במבנים הסמוכים לחדרים). כאן מתוארות שיטות לביצוע זריקות ICV ביד חופשית בעכברים בוגרים. על ידי שימוש בציוני דרך חזותיים ומישושיים על ראשי עכברים, זריקות לחדרים הרוחביים יכולות להתבצע במהירות ובאמינות. ההזרקות נעשות באמצעות מזרק זכוכית המוחזק בידו של הנסיין ומונח במרחקים משוערים מציוני הדרך. לפיכך, טכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית. יתר על כן, טכניקה זו דורשת רק הרדמה איזופלורנית קצרה, המאפשרת הערכה עוקבת של התנהגות עכבר ו / או פיזיולוגיה בעכברים ערים המתנהגים בחופשיות. הזרקת ICV ביד חופשית היא כלי רב עוצמה להעברה יעילה של חומרים ניסיוניים למוחם של עכברים חיים, וניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות כגון דגימת דם תכופה, מניפולציה של מעגלים עצביים או הקלטה in vivo כדי לחקור תהליכים נוירואנדוקריניים.
Introduction
אספקת חומרים ניסיוניים, כגון תרופות1, וירוסים2 או תאים3, למוח נחוצה לעתים קרובות למחקר נוירואנדוקריני. אם הסוכן אינו חוצה בקלות את מחסום הדם-מוח או שמטרת הניסוי היא לבדוק באופן ספציפי את ההשפעות המרכזיות של הסוכן, חשוב שתהיה שיטה אמינה להעברת זריקות למוח. יתר על כן, הזרקה לחלל התוך-מוחי (ICV) מספקת הזדמנות להפיץ את החומר באופן נרחב במוח ומספקת אזור מטרה גדול, ובכך מגדילה את הסיכוי להזרקה מוצלחת2.
שיטה נפוצה לביצוע זריקות ICV כוללת מיקום של צינורית מגורים קבועה. בגישה זו, יש צורך במסגרת סטריאוטקסית כדי למקם את הצינורית הזמינה מסחרית או בהתאמה אישית, שכן הצינורית מודבקת או מלטת במקומה. לעתים קרובות, עם ההתאוששות, מינון supraphysiological של אנגיוטנסין II מנוהל דרך הצינורית, ואם התנהגות השתייה נצפתה מיד, אז הצינורית נחשבת ממוקמת כראוי4. לגישה זו יתרונות רבים, ביניהם היכולת לבצע עירוי ארוך טווח והיכולת להזריק לאותו בעל חיים מספר פעמים; בנוסף, אם אנגיוטנסין II מועסק, מיקום נכון ניתן לאשר לפני הממשל של תרכובות ניסיוניות. עם זאת, ישנן כמה מגבלות להצבת צינורית קבועה, כולל הדרישה לציוד יקר (מסגרת סטריאוטקסית), האפשרות לנזק לצינורית לאחר הנחתה (למשל, עכברים יכולים ללעוס צינורית של חבר לכלוב), והאפשרות של זיהומים סביב הצינורית הקבועה. זריקות ICV בודדות יכולות להתבצע באמצעות מסגרת סטריאוטקסית3, אשר, למרות יעילותה, דורשת חשיפה משמעותית להרדמה, ולכן עשויה לטשטש כמה השפעות פיזיולוגיות והתנהגותיות חריפות של הטיפול. בנוסף, מיקום עכברים במסגרת סטריאוטקסית דורש אימון משמעותי להשגת מיקום יציב ומניעת קריעה של תעלות האוזן.
כאן מתוארת שיטה מבוססת לביצוע זריקות ביד חופשית בעכברים. שיטה זו מבוססת על דוחות קודמים 5,6. היתרונות של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, מהירה, ואינה דורשת ציוד מיוחד כגון מסגרת סטריאוטקסית. כפי שיתואר להלן, הליך זה כרוך מניפולציה מזרק זכוכית ביחס ציוני דרך על ראש העכבר כדי לבצע את הזריקות, אשר ניתן לעשות במהירות, ולכן, דורש רק כמה דקות של הרדמה גז ביום הניסוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן מתואר אמצעי פשוט ויעיל לביצוע זריקות ICV בעכברים. מכיוון שטכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית, גישה זו להעברה מרכזית של תרופות וסוכני ניסוי נגישה לחוקרים נוספים. בנוסף, גישה זו היא תפוקה גבוהה יחסית שכן הליך ההכנה וההזרקה יכול להתבצע במהירות.
מכיוון שהליך זה דורש מניפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר קלי ברין צ’רץ’, למר מייקל קרייסמן ולגב’ ג’סיקה ג’אנג על תרומתם לאיסוף הנתונים המוצגים בתוצאות המייצגות. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R00 HD104994 (R.B.M).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
