Intracerebroventrikulära injektioner på fri hand hos möss
Summary
Här beskrivs ett enkelt och snabbt tillvägagångssätt för att utföra intracerebroventrikulära injektioner på möss med hjälp av en frihandsmetod (det vill säga utan en stereotaktisk enhet).
Abstract
Undersökningen av neuroendokrina system kräver ofta leverans av läkemedel, virus eller andra experimentella medel direkt in i hjärnan hos möss. En injektion av intracerebroventrikulär (ICV) gör det möjligt att i stor utsträckning leverera det experimentella medlet i hela hjärnan (särskilt i strukturerna nära kamrarna). Här beskrivs metoder för att göra ICV-injektioner på fri hand hos vuxna möss. Genom att använda visuella och taktila landmärken på mössens huvuden kan injektioner i de laterala ventriklarna göras snabbt och tillförlitligt. Injektionerna görs med en glasspruta som hålls i försöksledarens hand och placeras på ungefärligt avstånd från landmärkena. Således kräver denna teknik inte en stereotaktisk ram. Dessutom kräver denna teknik endast kortvarig isoflurananebedövning, vilket möjliggör efterföljande bedömning av musbeteende och/eller fysiologi hos vakna möss som beter sig fritt. ICV-injektion på fri hand är ett kraftfullt verktyg för effektiv leverans av experimentella medel till hjärnan hos levande möss och kan kombineras med andra tekniker som frekvent blodprovstagning, manipulation av neurala kretsar eller in vivo-inspelning för att undersöka neuroendokrina processer.
Introduction
Leverans av experimentella ämnen, såsom läkemedel1, virus2 eller celler3, till hjärnan är ofta nödvändigt för neuroendokrin forskning. Om medlet inte lätt passerar blod-hjärnbarriären eller om det experimentella målet är att specifikt testa de centrala effekterna av medlet, är det viktigt att ha en tillförlitlig metod för att leverera injektioner i hjärnan. Dessutom ger injektion i det intracerebroventrikulära (ICV) utrymmet möjlighet att distribuera medlet brett i hjärnan och ger ett stort målområde, vilket ökar sannolikheten för framgångsrik injektion2.
En vanlig metod för att göra ICV-injektioner är att placera en permanent kvarliggande kanyl. I detta tillvägagångssätt är en stereotaktisk ram nödvändig för att positionera den kommersiellt tillgängliga eller specialtillverkade kanylen, eftersom kanylen limmas eller cementeras på plats. Ofta, vid återhämtning, administreras en suprafysiologisk dos av angiotensin II genom kanylen, och om dryckesbeteende omedelbart observeras, anses kanylen vara korrekt placerad4. Detta tillvägagångssätt har många fördelar, bland annat möjligheten att utföra långvarig infusion och möjligheten att injicera samma djur flera gånger. Dessutom, om angiotensin II används, kan korrekt placering bekräftas före administrering av experimentella substanser. Det finns dock vissa begränsningar för att placera en permanent kanyl, inklusive kravet på dyr utrustning (stereotaktisk ram), risken för skador på kanylen efter placering (t.ex. kan möss tugga på kanylen på en burkamrat) och risken för infektioner runt den permanenta kanylen. Enstaka ICV-injektioner kan göras med hjälp av en stereotaktisk ram3, som, även om den är effektiv, kräver betydande exponering för anestesi och därmed kan dölja vissa akuta fysiologiska och beteendemässiga effekter av behandlingen. Dessutom kräver placeringen av möss i en stereotaktisk ram omfattande träning för att uppnå stabil placering och förhindra att hörselgångarna brister.
Här beskrivs en etablerad metod för att göra frihandsinjektioner i möss. Denna metod är baserad på tidigare rapporter 5,6. Fördelarna med denna teknik är att den är enkel, snabb och inte kräver specialutrustning som en stereotaktisk ram. Som beskrivs nedan innebär denna procedur att man manipulerar en glasspruta i förhållande till landmärken på mushuvudet för att göra injektionerna, vilket kan göras snabbt och därför kräver endast några minuters gasbedövning på experimentdagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs ett enkelt och effektivt sätt att göra ICV-injektioner i möss. Eftersom denna teknik inte kräver en stereotaktisk ram, är detta tillvägagångssätt för central leverans av läkemedel och experimentella medel tillgängligt för fler forskare. Dessutom är detta tillvägagångssätt relativt högt genomströmning eftersom berednings- och injektionsproceduren kan utföras snabbt.
Eftersom denna procedur kräver manipulering av nålar och en glasspruta för hand med ungefärli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr. Kellie Breen Church, Mr. Michael Kreisman och Ms. Jessica Jang för deras bidrag till att samla in data som visas i de representativa resultaten. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
