Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar
Summary
Burada, farelerde serbest el yaklaşımı kullanarak (yani stereotaksik bir cihaz olmadan) intraserebroventriküler enjeksiyonlar yapmak için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklanmaktadır.
Abstract
Nöroendokrin sistemlerin araştırılması genellikle ilaçların, virüslerin veya diğer deneysel ajanların doğrudan farelerin beyinlerine verilmesini gerektirir. İntraserebroventriküler (ICV) enjeksiyon, deneysel ajanın beyin boyunca (özellikle ventriküllerin yakınındaki yapılarda) yaygın olarak verilmesine izin verir. Burada, yetişkin farelerde serbest el ICV enjeksiyonları yapma yöntemleri açıklanmaktadır. Farelerin kafalarındaki görsel ve dokunsal işaretler kullanılarak, lateral ventriküllere enjeksiyonlar hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilir. Enjeksiyonlar, deneycinin elinde tutulan bir cam şırınga ile yapılır ve yer işaretlerinden yaklaşık mesafelere yerleştirilir. Bu nedenle, bu teknik stereotaksik bir çerçeve gerektirmez. Ayrıca, bu teknik, uyanık, serbestçe davranan farelerde fare davranışının ve / veya fizyolojisinin daha sonra değerlendirilmesine izin veren sadece kısa izofluran anestezisi gerektirir. Serbest el ICV enjeksiyonu, deneysel ajanların canlı farelerin beyinlerine verimli bir şekilde verilmesi için güçlü bir araçtır ve nöroendokrin süreçleri araştırmak için sık kan örneklemesi, nöral devre manipülasyonu veya in vivo kayıt gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir.
Introduction
İlaç1, virüs2 veya hücre3 gibi deneysel ajanların beyne verilmesi genellikle nöroendokrin araştırmalar için gereklidir. Ajan kan-beyin bariyerini kolayca geçmiyorsa veya deneysel amaç, ajanın merkezi etkilerini spesifik olarak test etmekse, beyne enjeksiyon yapmak için güvenilir bir yönteme sahip olmak önemlidir. Ayrıca intraserebroventriküler (ICV) boşluğa enjeksiyon, ajanın beyinde geniş bir alana yayılmasına olanak sağlar ve geniş bir hedef alan sağlar, böylece başarılı enjeksiyon olasılığını artırır2.
ICV enjeksiyonları yapmak için yaygın bir yöntem, kalıcı bir kalıcı kanülün yerleştirilmesini içerir. Bu yaklaşımda, kanül yerine yapıştırıldığı veya yapıştırıldığı için ticari olarak temin edilebilen veya ısmarlama kanülü konumlandırmak için stereotaksik bir çerçeve gereklidir. Genellikle, iyileşmeden sonra, kanül yoluyla suprafizyolojik bir anjiyotensin II dozu uygulanır ve içme davranışı hemen gözlenirse, kanülün doğru yerleştirildiği kabul edilir4. Bu yaklaşımın, uzun süreli infüzyon gerçekleştirme yeteneği ve aynı hayvanı birden çok kez enjekte etme yeteneği dahil olmak üzere birçok avantajı vardır; Ek olarak, anjiyotensin II kullanılırsa, deneysel bileşiklerin uygulanmasından önce doğru yerleştirme doğrulanabilir. Bununla birlikte, pahalı ekipman gereksinimi (stereotaksik çerçeve), yerleştirmeden sonra kanülün hasar görme olasılığı (örneğin, fareler bir kafes arkadaşının kanülünü çiğneyebilir) ve kalıcı kanül çevresinde enfeksiyon olasılığı dahil olmak üzere kalıcı bir kanül yerleştirmenin bazı sınırlamaları vardır. Tek ICV enjeksiyonları, etkili olmasına rağmen, anesteziye önemli ölçüde maruz kalmayı gerektiren ve bu nedenle tedavinin bazı akut fizyolojik ve davranışsal etkilerini gizleyebilen bir stereotaksik çerçeve3 kullanılarak yapılabilir. Ek olarak, farelerin stereotaksik bir çerçeveye yerleştirilmesi, sabit bir yerleştirme elde etmek ve kulak kanallarının yırtılmasını önlemek için önemli bir eğitim gerektirir.
Burada, farelerde serbest el enjeksiyonları yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem önceki raporlaradayanmaktadır 5,6. Bu tekniğin avantajları, basit, hızlı olması ve stereotaksik çerçeve gibi özel ekipman gerektirmemesidir. Aşağıda tarif edildiği gibi, bu prosedür, hızlı bir şekilde yapılabilen ve bu nedenle deney gününde sadece birkaç dakikalık gaz anestezisi gerektiren enjeksiyonları yapmak için fare kafasındaki yer işaretlerine göre bir cam şırınganın manipüle edilmesini içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, farelerde ICV enjeksiyonları yapmak için basit ve etkili bir araç açıklanmaktadır. Bu teknik stereotaksik bir çerçeve gerektirmediğinden, ilaçların ve deneysel ajanların merkezi olarak verilmesi için bu yaklaşım daha fazla araştırmacı tarafından erişilebilir. Ek olarak, hazırlama ve enjeksiyon prosedürü hızlı bir şekilde gerçekleştirilebildiğinden bu yaklaşım nispeten yüksek verimdir.
Bu prosedür, iğnelerin ve bir cam şırınganın yaklaşık mesafele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Kellie Breen Church, Bay Michael Kreisman ve Bayan Jessica Jang’a temsili sonuçlarda gösterilen verilerin toplanmasına katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R00 HD104994 (RBM) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 18-gauge blunt needles | SAI Infusion | B18-150 | |
| 18-gauge needles | BD Medical | 305195 | |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Bench pad | Fisher Scientific | 14-206-62AC22 | |
| Betadine solution | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| Buprenorphine | Patterson Vet Supply | 07-892-5235 | Controlled substance |
| Eyelube | Fisher Scientific | 50-218-8442 | |
| Glass syringe | Hamilton | 7634-01 | |
| Injection needle | Hamilton | 7803-01 | 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45 |
| Isoflurane | Patterson Vet Supply | 07-893-8441 | |
| Isoflurane vaporizer | Vet Equip | V-10 | |
| Laboratory Tape | VWR | 89098-128 | |
| Medical grade oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| Paraformaldehyde | Millipore-Sigma | 8.18715.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | J67802.K2 | |
| PulsaR Software | Open source, University of Otago | See ref 9 | |
| Ruler | Fisher Scientific | 12-00-152 | |
| Silastic tubing (0.040" I.D.) | DOW | 508-005 | |
| Silastic tubing (0.078" I.D.) | DOW | 508-009 | |
| Sterile saline | VWR | 101320-574 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 |
References
- Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
- Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
- Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
- Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
- Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
- Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).
