Här beskrivs en etablerad metod för att utföra kontraktilitet och kalciummätningar i humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter med hjälp av en optikbaserad plattform. Denna plattform gör det möjligt för forskare att studera effekten av mutationer och svaret på olika stimuli på ett snabbt och reproducerbart sätt.
Humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CMs) representerar ett kraftfullt verktyg för att studera mutationsmedierade förändringar i kardiomyocytfunktionen och definiera effekterna av stressorer och läkemedelsinterventioner. I denna studie demonstreras att detta optikbaserade system är ett kraftfullt verktyg för att bedöma de funktionella parametrarna för hiPSC-CM i 2D. Genom att använda denna plattform är det möjligt att utföra parade mätningar i en välbevarad temperaturmiljö på olika plattlayouter. Dessutom ger detta system forskare omedelbar dataanalys.
Detta dokument beskriver en metod för att mäta kontraktilitet av omodifierade hiPSC-CM. Kontraktionskinetiken mäts vid 37 °C baserat på pixelkorrelationsförändringar i förhållande till en referensram som tagits vid avkoppling vid en samplingsfrekvens på 250 Hz. Dessutom kan samtidiga mätningar av intracellulära kalciumtransienter förvärvas genom att ladda cellen med en kalciumkänslig fluorofor, såsom Fura-2. Med hjälp av en hyperswitch kan ratiometriska kalciummätningar utföras på en belysningspunkt med en diameter på 50 μm, motsvarande arean för kontraktilitetsmätningarna.
Hjärtsvikt är den vanligaste dödsorsaken i världen. År 2019 orsakade hjärt-kärlsjukdomar 18.6 miljoner dödsfall globalt, vilket återspeglar en ökning med 17.1% under det senaste decenniet1. Trots forskarnas ansträngningar att identifiera läkemedelsmål för att förebygga och bota hjärtsvikt är patientresultaten fortfarande dåliga2. Skillnaden i patofysiologin hos djurmodeller med avseende på människor kan vara en av de bakomliggande faktorerna till den begränsade framgången för optimering av hjärtsviktsbehandling3. Ytterligare människoliknande modeller är motiverade för att modellera sjukdomar och testa toxiciteten och effektiviteten hos nya läkemedelsföreningar.
Humant inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) representerar ett kraftfullt verktyg för att definiera cellulära patomekanismer inducerade av stressorer, ischemi, förändrad metabolism eller patogena genvarianter och effektiviteten och toxiciteten hos läkemedelsinterventioner4. För att definiera effekter på de funktionella egenskaperna hos hiPSC-CM är ett höghastighetssystem som mäter de systoliska och diastoliska egenskaperna hos cellulära sammandragningar på ett opartiskt och reproducerbart sätt motiverat. Detta övergripande mål med den aktuella studien är att visa att ett optikbaserat system är ett kraftfullt verktyg för att utföra realtidsanalyser av de funktionella parametrarna för hiPSC-CMs.
För närvarande finns det flera plattformar för att utvärdera kontraktiliteten hos hiPSC-CM. Men nuvarande system erbjuder antingen en långsam avläsning, eller det nödvändiga antalet celler kan vara en utmaning. Etikettfria videomätningssystem5,6 förlitar sig på post-hoc-analys av videor, vilket kräver mycket lagring och saknar direkt feedback under videoförvärv. Dessutom är tillräcklig tidsmässig och rumslig upplösning svår att uppnå och kan leda till underurval. Andra metoder för att bestämma kardiomyocytegenskaper, såsom klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / Cas9-redigerade hiPSC-CMs7 med fluorescerande reportrar kan störa cellernas genstabilitet och kräva specialiserad laboratorieexpertis.
För att övervinna de begränsningar som nämns ovan utvecklades och introducerades ett unikt optikbaserat mätsystem i denna studie. Denna plattform möjliggör kontraktilitetsmätningar på omodifierade hiPSC-CM genom att helt enkelt plätera om dem på valfritt plattformat, utan någon begränsning i plåtstorlek. Dessutom möjliggör realtidsmätningar direkt observation och analys av de funktionella parametrarna för hiPSC-CM, och ger därmed en experimentell inställning för att omedelbart justera och optimera protokoll. Dessutom lagras platsen för varje mätning, vilket möjliggör parade mätningar på samma prov, vilket ökar experimentens kraft.
För att demonstrera det optikbaserade systemet utfördes kontraktilitetsmätningar på en kontroll-hiPSC-CM-linje. Denna kontroll-hiPSC-linje genererades från dermal fibroblast hos en frisk manlig donator med en normal karyotyp8. Kontraktionskinetiken mättes vid 37 °C, baserat på pixelkorrelationsförändringar i förhållande till en referensram som togs under avkoppling vid en samplingsfrekvens på 250 Hz. Eftersom den exakta starten på kontraktionen inte alltid kan fastställas entydigt, togs den tidpunkt då 20% av topphöjden uppnåddes (tid till topp 20%) som utgångspunkt för mätningar av tid till topp. På så sätt hittades mindre variabilitet för den här parametern i ett prov. På samma sätt, eftersom det exakta ögonblicket då signalen återgår till baslinjen är svårt att bedöma, användes den tid det tog att nå 80% av återgången till baslinjen från topp (tid till baslinje 80%) för att beskriva avkopplingstiden.
Övergripande kontraktilitetsmätningar inkluderade viloslagfrekvenser, tiden från 20% topp till toppkontraktion (TP. Con), och tiden från maximal kontraktion till 80% av baslinjen (TB. Con80) (figur 1B). För att testa effekten av en stressfaktor inkuberades celler med isoprenalin (ISO). Dessutom, i samband med kontraktilitetsmätningar, mättes Ca 2+ transienter genom att ladda cellerna med Fura-2-acetoximetylester (Fura-2 AM) vid en provtagningsfrekvens på 250 Hz. Ratiometriska Ca2+ mätningar 9 med en hyperswitch gjordes på ett belysningsområde med en diameter på 50 μm, motsvarande arean för kontraktilitetsmätningarna. Ca 2+ mätdata visas som tid från 20% topp till topp i Ca2+ transient (TP.Ca) och tiden från topp till 80% av baslinjen (TB.Ca80) (Figur 1C). Ett snabbt, automatiskt dataanalysverktyg användes för att ge genomsnittliga kontraktila och kalciumkinetiska parametrar för varje område.
I denna studie beskrivs en metod för att utföra kontraktilitet och kalciumtransienta mätningar på hiPSC-CMs och studera effekten av stressorer/läkemedel på dessa celler. Kontraktilitetsmätningar, ratiometriska kalciummätningar och svaret på ISO utfördes på tre olika differentieringsrundor som biologiska replikat. För varje biologisk replikat utfördes mätningar på tre brunnar som de tekniska replikaten. Anledningen till att mätningarna utfördes på detta sätt var att säkerställa att den biologiska variationen och den tekniska variationen i provet och plattformen kunde utvärderas. Förutom att överväga lämpligt antal biologiska och tekniska replikat kan hiPSC-CM-odlingstillståndet spela en viktig roll för att uppnå konstanta och robusta resultat. Det är viktigt att vara konsekvent med kriterier, såsom ålder på hiPSC-CM, sammansättning av medium, replatingförhållanden och sammansatt inkubationstid under mätningar. I denna studie tog det i genomsnitt 568 ± 24 s att mäta 11 områden två gånger för 10 s i en brunn. Detta inkluderar en ISO-inkubationstid på 79 ± 11 s. Detta kommer ner till ungefär 10 min per brunn, vilket borde göra det möjligt för forskare att mäta en hel 24-brunnsplatta på ~ 4 timmar. Klimatkontrollen används för att upprätthålla stabil CO2. Detta gör det möjligt att mäta effekten av föreningar/stressfaktorer på hiPSC-CM på ett höghastighetssätt.
För att mäta kontraktil funktion av iPSC-CMs finns det flera befintliga system som förlitar sig på optogenetik13 eller etikettfri videobaserad mikroskopi 5,6. Optogenetiska system är ganska komplexa och kräver speciella tekniker för att erhålla antingen elektrofysiska och / eller kontraktilitetsdata. Andra system förlitar sig på post-hoc-analys av videor, vilket kräver mycket lagring och saknar direkt feedback under videoförvärv. Dessutom är tillräcklig tidsmässig och rumslig upplösning svår att uppnå, vilket kan leda till underurval. På samma sätt kan CRISPR / CAS-9-redigerade hiPSC-CMs med fluorescerande reportrar7 introducera oönskade effekter på kardiomyocytbeteende. Användningen av fluorescerande färgämnen för kontraktionsavslappningsmätningar är också ett elegant tillvägagångssätt, men begränsar att utföra experiment på samma prov under en längre period14.
Denna optikbaserade mätplattform kan dock användas för att mäta sammandragningsavslappningstider utan att använda något fluorescerande färgämne eller invasiva metoder. Men eftersom pixelkorrelation inte ger rumslig information kan denna metod inte användas för att mäta styrkan av sammandragning, utan kan snarare bara på ett tillförlitligt sätt upptäcka förändringar i hastigheten för sammandragning och avkoppling. Det introducerade mätsystemet är temperaturkontrollerat och kan samla in kalcium- och kontraktilitetsdata i realtid med en upplösning på > 200 bilder per sekund. Dessutom lagras platsen för varje mätning, vilket möjliggör parade mätningar, vilket ökar experimentens kraft. Dessutom ger denna plattform forskare möjlighet att lagra data och analysera dem direkt efter experimentet. Sammantaget visar sig detta optikbaserade mätsystem vara en lovande metod för att studera cellulära patomekanismer, kan utvärdera effekten av föreningar på funktionaliteten hos hiPSC-CMs och kan vara till hjälp med den prekliniska processen vid läkemedelsscreening.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har delvis finansierats av Eurostars grant Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) och NWO-VICI grant 91818602 (JV).
µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |