Legatura atriale sinistra nell'embrione aviario come modello per l'alterato carico emodinamico durante lo sviluppo vascolare precoce

Summary

Qui, presentiamo un protocollo visivo dettagliato per l’esecuzione del modello di legatura atriale sinistra (LAL) nell’embrione aviario. Il modello LAL altera il flusso intracardiaco, che modifica il carico di sollecitazione da taglio della parete, imitando la sindrome del cuore sinistro ipoplasico. Viene presentato un approccio per superare le sfide di questo difficile modello di microchirurgia.

Abstract

Grazie alla sua configurazione ventricolare matura a quattro camere, alla facilità di coltura, all’accesso all’imaging e all’efficienza, l’embrione aviario è un modello animale vertebrato preferito per lo studio dello sviluppo cardiovascolare. Gli studi che mirano a comprendere lo sviluppo normale e la prognosi dei difetti cardiaci congeniti adottano ampiamente questo modello. Vengono introdotte tecniche chirurgiche microscopiche per alterare i normali modelli di carico meccanico in uno specifico momento embrionale e tracciare la cascata molecolare e genetica a valle. Gli interventi meccanici più comuni sono la legatura della vena vitellina sinistra, il bendaggio conotruncale e la legatura atriale sinistra (LAL), che modula la pressione vascolare intramurale e lo stress da taglio della parete dovuto al flusso sanguigno. La LAL, in particolare se eseguita in ovo, è l’intervento più impegnativo, con rese di campione molto ridotte a causa delle operazioni microchirurgiche sequenziali estremamente fini. Nonostante il suo alto rischio, in ovo la LAL è molto preziosa dal punto di vista scientifico in quanto imita la patogenesi della sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS). L’HLHS è una cardiopatia congenita complessa clinicamente rilevante osservata nei neonati umani. Un protocollo dettagliato per l’in ovo LAL è documentato in questo documento. In breve, gli embrioni aviari fecondati sono stati incubati a 37,5 °C e al 60% di umidità costante fino a quando non hanno raggiunto gli stadi di Hamburger-Hamilton (HH) da 20 a 21. I gusci delle uova sono stati aperti e le membrane esterne e interne sono state rimosse. L’embrione è stato ruotato delicatamente per esporre il bulbo atriale sinistro dell’atrio comune. I micro-nodi pre-assemblati da suture di nylon 10-0 sono stati delicatamente posizionati e legati attorno alla gemma atriale sinistra. Infine, l’embrione è stato riportato nella sua posizione originale e LAL è stato completato. I ventricoli normali e quelli strumentati con LAL hanno dimostrato differenze statisticamente significative nella compattazione dei tessuti. Un’efficiente pipeline di generazione di modelli LAL contribuirebbe a studi incentrati sulla manipolazione meccanica e genetica sincronizzata durante lo sviluppo embrionale delle componenti cardiovascolari. Allo stesso modo, questo modello fornirà una fonte di cellule perturbate per la ricerca sulle colture tissutali e la biologia vascolare.

Introduction

I difetti cardiaci congeniti (CHD) sono disturbi strutturali che si verificano a causa di uno sviluppo embrionale anormale¹. Oltre alle condizioni genetiche, la patogenesi è influenzata da un alterato carico meccanico ^2,3. La sindrome del cuore sinistro ipoplasico (HLHS), una cardiopatia congenita, provoca un ventricolo/aorta sottosviluppato alla nascita⁴ con un alto tasso di mortalità ^5,6. Nonostante i recenti progressi nella sua gestione clinica, la crescita vascolare e le dinamiche di sviluppo dell’HLHS non sono ancora chiare⁷. Nel normale sviluppo embrionale, l’endocardio e il miocardio del ventricolo sinistro (LV) originano dai progenitori cardiaci man mano che la formazione precoce del tubo cardiaco embrionale progredisce. Viene segnalata la presenza graduale di trabecolazione miocardica, ispessimento degli strati e proliferazione dei cardiomiociti². Per l’HLHS, si osserva un alterato rimodellamento trabecolare e un appiattimento ventricolare sinistro, che contribuiscono ulteriormente all’ipoplasia miocardica dovuta a una migrazione anomala dei cardiomiociti 2,8,9,10

Tra gli organismi modello ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cuore e comprendere le condizioni emodinamiche 11, l’embrione aviario è preferito per il suo cuore maturo a quattro camere e la sua facilità di coltura^11,12,13,14. D’altra parte, l’accesso avanzato all’imaging di embrioni di zebrafish e topi transgenici/knockout offre vantaggi distinti^11,12. Per l’embrione aviario sono stati testati vari interventi meccanici che alterano la pressione intramurale e lo stress da taglio della parete nello sviluppo di componenti cardiovascolari. Questi modelli includono la legatura vitellina sinistra, il bendaggio connotruncale¹⁵ e la legatura atriale sinistra (LAL)^11,12,16. Il fenotipo risultante dovuto all’alterato carico meccanico può essere osservato circa 24-48 ore dopo l’intervento chirurgico in studi incentrati sulla prognosi precoce^11,13. L’intervento LAL è una tecnica popolare per restringere il volume funzionale dell’atrio sinistro (LA) posizionando un’ansa di sutura attorno all’apertura atrioventricolare. Allo stesso modo, sono stati eseguiti anche interventi microchirurgici che mirano alla legatura atriale destra (RAL)^17,18. Allo stesso modo, alcuni ricercatori prendono di mira l’appendice atriale sinistra (LAA) utilizzando micro clip per ridurre il volume del LA^19,20. In alcuni studi, un filo di nylon chirurgico viene applicato al nodo atrioventricolare ^19,21. Uno degli interventi utilizzati è il LAL, che può imitare l’HLHS ma è anche il modello più difficile da eseguire, con rese di campione molto ridotte a causa delle operazioni microchirurgiche estremamente fini richieste. Nel nostro laboratorio, la LAL viene eseguita in ovo tra gli stadi 20 e 21 di Hamburger-Hamilton (HH), prima che l’atrio comune sia completamente settato 6,14,22,23. Una sutura chirurgica viene posizionata intorno al LA, che altera i flussi di flusso sanguigno intracardiaco. Nei modelli LAL di HLHS, si osserva un aumento della rigidità della parete ventricolare, angoli alterati della miofibra e una diminuzione delle dimensioni della cavità ventricolare sinistra^14,24.

In questo video articolo, viene fornito un protocollo e un approccio dettagliati per in ovo LAL. In breve, gli embrioni aviari fecondati sono stati incubati per la microchirurgia, il guscio dell’uovo è stato aperto e le membrane esterne e interne sono state ripulite. L’embrione è stato poi ruotato lentamente in modo che il LA fosse accessibile. Una sutura chirurgica in nylon 10-0 è stata legata alla gemma atriale e l’embrione è stato riportato al suo orientamento originale, completando la procedura LAL²⁵. I ventricoli LAL e normali vengono confrontati per la compattazione tissutale e il volume del ventricolo tramite tomografia a coerenza ottica e istologia di base.

Una pipeline di modelli LAL eseguita con successo, come descritto qui, contribuirà agli studi di base incentrati sullo sviluppo embrionale delle componenti cardiovascolari. Questo modello può essere utilizzato anche insieme a manipolazioni genetiche e modalità di imaging avanzate. Allo stesso modo, il modello LAL acuto è una fonte stabile di cellule vascolari malate per esperimenti di coltura tissutale.

Protocol

Le uova di Livorno bianco fertile sono ottenute da fornitori di fiducia e incubate secondo linee guida approvate dall’università. Gli embrioni di pulcino, stadi da 18 (giorno 3) a 24 (giorno 4) (gli stadi presentati in questo articolo) non sono considerati animali vertebrati vivi dalla direttiva dell’Unione Europea (UE) 2010/63/UE e dalle linee guida del comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) negli Stati Uniti. Gli embrioni di pulcino sono considerati “animali vivi” dopo il 19° giorno di incub…

Representative Results

Tecniche avanzate di imaging risolte nel tempo possono essere impiegate per osservare i cambiamenti strutturali e morfologici dovuti all’intervento LAL10. Inoltre, i campioni di LAL sono anche suscettibili di metodi molecolari e biologici19,28. Nella Tabella 1 sono riportati gli studi di esempio che hanno utilizzato i risultati del modello LAL. In questo contesto, l’intervento di LAL è stato eseguito in embrioni di pulcin…

Discussion

Nell’HLHS, il flusso sanguigno è alterato a causa di difetti strutturali, che portano a una morfologia anomala sul lato sinistro ^4,6. Il presente modello fornisce un sistema sperimentale pratico per comprendere meglio la progressione dell’HLHS e può anche imitare la sua patogenesi⁸. Tuttavia, stabilire un modello animale HLHS completamente equivalente dal punto di vista clinico è un compito impegnativo. Oltre al modello LAL aviario qui …

Materials

10-0 nylon surgical suture	Ethicon
Elastica van Gieson staining kit	Sigma-Aldrich	115974	For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute	Interlab	64-17-5	For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator	KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A	AZYSS600-110
Kimwipes	Interlab	080.65.002
Microscissors	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	555640S	Vannas STR 82 mm
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk	Leica Biosystems	39602012	Tissue embedding medium
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 508	Stemi 508	Used at station 1
Stereo Microscope	Zeiss Stemi 2000-C	Stemi 2000-C	Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4)	Adumont & Fils, Switzerland		Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL	501985	Used to remove the membranes on the embryo