JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Erken Vasküler Gelişim Sırasında Değişen Hemodinamik Yükleme için Bir Model Olarak Kuş Embriyosunda Sol Atriyal Ligasyon

Published: June 16, 2023
doi:
10.3791/65330
, , ,
1Department of Biomedical Sciences and Engineering,Koc University, 2Department of Mechanical Engineering,Koc University

Summary

Burada, kuş embriyosunda sol atriyal ligasyon (LAL) modelinin yürütülmesi için ayrıntılı bir görsel protokol sunuyoruz. LAL modeli, hipoplastik sol kalp sendromunu taklit ederek duvar kesme gerilimi yükünü değiştiren intrakardiyak akışı değiştirir. Bu zor mikrocerrahi modelinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir yaklaşım sunulmaktadır.

Abstract

Dört odacıklı olgun ventriküler konfigürasyonu, kültür kolaylığı, görüntüleme erişimi ve verimliliği nedeniyle, kuş embriyosu kardiyovasküler gelişimi incelemek için tercih edilen bir omurgalı hayvan modelidir. Normal gelişimi ve konjenital kalp defekti prognozunu anlamaya yönelik çalışmalar bu modeli yaygın olarak benimsemektedir. Belirli bir embriyonik zaman noktasında normal mekanik yükleme modellerini değiştirmek ve aşağı akış moleküler ve genetik kaskadı izlemek için mikroskobik cerrahi teknikler tanıtıldı. En sık yapılan mekanik girişimler sol vitellin ven ligasyonu, konorunkal bantlama ve sol atriyal ligasyondur (LAL), intramural vasküler basıncı ve kan akımına bağlı duvar kayma stresini modüle eder. LAL, özellikle ovo’da yapıldığında, son derece ince ardışık mikrocerrahi operasyonlar nedeniyle çok küçük numune verimleri ile en zorlu müdahaledir. Yüksek riskine rağmen in ovo LAL, hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS) patogenezini taklit ettiği için bilimsel olarak çok değerlidir. HLHS, insan yenidoğanlarında gözlenen klinik olarak anlamlı, karmaşık bir konjenital kalp hastalığıdır. Bu yazıda in ovo LAL için ayrıntılı bir protokol belgelenmiştir. Kısaca, döllenmiş kuş embriyoları, tipik olarak Hamburger-Hamilton (HH) aşamaları 20 ila 21’e ulaşana kadar 37.5 ° C’de ve% 60 sabit nemde inkübe edildi. Yumurta kabukları kırılarak açıldı ve dış ve iç zarlar çıkarıldı. Embriyo, ortak atriyumun sol atriyal ampulünü ortaya çıkarmak için hafifçe döndürüldü. 10-0 naylon sütürlerden önceden monte edilmiş mikro düğümler nazikçe konumlandırıldı ve sol atriyal tomurcuğun etrafına bağlandı. Son olarak, embriyo orijinal konumuna geri döndürüldü ve LAL tamamlandı. Normal ve LAL aletli ventriküller doku sıkışmasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterdi. Verimli bir LAL model üretim hattı, kardiyovasküler bileşenlerin embriyonik gelişimi sırasında senkronize mekanik ve genetik manipülasyona odaklanan çalışmalara katkıda bulunacaktır. Benzer şekilde, bu model doku kültürü araştırmaları ve vasküler biyoloji için bozulmuş bir hücre kaynağı sağlayacaktır.

Introduction

Konjenital kalp defektleri (KKH’ler), anormal embriyonik gelişime bağlı olarak ortaya çıkan yapısal bozukluklardır1. Genetik koşullara ek olarak, patogenez değişen mekanik yüklemedenetkilenir 2,3. Konjenital bir kalp hastalığı olan hipoplastik sol kalp sendromu (HLHS), doğumda az gelişmiş bir ventrikül/aort ile sonuçlanır4 ve yüksek mortaliteoranı 5,6. Klinik yönetimindeki son gelişmelere rağmen, HLHS’nin vasküler büyüme ve gelişme dinamikleri hala belirsizdir7. Normal embriyonik gelişimde, erken embriyonik kalp tüpü oluşumu ilerledikçe sol ventrikül (LV) endokard ve miyokard kardiyak progenitörlerden köken alır. Miyokardiyal trabekülasyon, kalınlaşma tabakaları ve kardiyomiyosit proliferasyonunun kademeli varlığı bildirilmiştir2. HLHS için, anormal kardiyomiyosit göçüne bağlı miyokardiyal hipoplaziye daha fazla katkıda bulunan değişmiş trabeküler yeniden şekillenme ve sol ventrikül düzleşmesi gözlenir 2,8,9,10

Kalp gelişimini incelemek ve hemodinamik durumları anlamak için yaygın olarak kullanılan model organizmalar arasında 11, kuş embriyosu dört odacıklı olgun kalbi ve kültür kolaylığı nedeniyle tercih edilmektedir11,12,13,14. Öte yandan, zebra balığı embriyolarının ve transgenik/nakavt farelerin gelişmiş görüntüleme erişimi belirgin avantajlar sağlar11,12. Gelişmekte olan kardiyovasküler bileşenlerde intramural basıncı ve duvar kesme stresini değiştiren kuş embriyosu için çeşitli mekanik müdahaleler test edilmiştir. Bu modeller arasında sol vitellin ligasyonu, konorunkal bantlama15 ve sol atriyal ligasyon (LAL)11,12,16 bulunur. Değişen mekanik yüklemeye bağlı olarak ortaya çıkan fenotip, erken prognoza odaklanan çalışmalarda cerrahi müdahaleden yaklaşık 24-48 saat sonra gözlenebilir11,13. LAL müdahalesi, atriyoventriküler açıklığın etrafına bir dikiş halkası yerleştirerek sol atriyumun (LA) fonksiyonel hacmini daraltmak için popüler bir tekniktir. Aynı şekilde, sağ atriyal ligasyonu (RAL) hedefleyen mikrocerrahi müdahaleler de gerçekleştirilmiştir17,18. Benzer şekilde, bazı araştırmacılar LA 19,20’nin hacmini azaltmak için mikro klipsler kullanarak sol atriyal apendiksleri (LAA) hedefler. Bazı çalışmalarda, atriyoventriküler düğüme cerrahi bir naylon iplik uygulanır19,21. Kullanılan müdahalelerden biri, HLHS’yi taklit edebilen ancak aynı zamanda yapılması en zor model olan, son derece ince mikrocerrahi operasyonlar nedeniyle çok küçük numune verimleri olan LAL’dir. Laboratuvarımızda LAL, ortak atriyum 6,14,22,23 tam bölünmeden önce, Hamburger-Hamilton (HH) evre 20 ve 21 arasında ovo olarak gerçekleştirilir. LA’nın etrafına, intrakardiyak kan akış akışlarını değiştiren bir cerrahi dikiş yerleştirilir. HLHS’nin LAL modellerinde artmış ventrikül duvar sertliği, değişmiş miyofiber açıları ve azalmış LV kavite boyutu gözlenmiştir14,24.

Bu video makalesinde, in ovo LAL için ayrıntılı bir protokol ve yaklaşım sunulmaktadır. Kısaca, döllenen kuş embriyoları mikrocerrahi için inkübe edildi, yumurta kabuğu çatlatılarak açıldı ve dış ve iç zarlar temizlendi. Embriyo daha sonra LA’ya erişilebilmesi için yavaşça döndürüldü. Atriyal tomurcuğa 10-0 naylon cerrahi sütür bağlandı ve embriyo orijinal oryantasyonuna geri döndürülerek LAL prosedürü25 tamamlandı. LAL ve normal ventriküller, optik koherens tomografi ve temel histoloji ile doku sıkışması ve ventrikül hacmi açısından karşılaştırıldı.

Burada açıklandığı gibi, başarılı bir şekilde yürütülen bir LAL model boru hattı, kardiyovasküler bileşenlerin embriyonik gelişimine odaklanan temel çalışmalara katkıda bulunacaktır. Bu model aynı zamanda genetik manipülasyonlar ve ileri görüntüleme yöntemleri ile birlikte de kullanılabilir. Benzer şekilde, akut LAL modeli, doku kültürü deneyleri için hastalıklı vasküler hücrelerin stabil bir kaynağıdır.

Protocol

Verimli beyaz Leghorn yumurtaları güvenilir tedarikçilerden elde edilir ve üniversite onaylı yönergelere göre kuluçkaya yatırılır. Civciv embriyoları, evre 18 (gün 3) ila 24 (gün 4) (bu yazıda sunulan aşamalar), Avrupa Birliği (AB) direktifi 2010/63/EU ve ABD’deki kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) yönergeleri tarafından canlı omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmemektedir. Civciv embriyoları, ABD yasalarına göre kuluçkanın 19. gününden sonra “canlı hayvan” olarak kabul …

Representative Results

LAL müdahalesine bağlı yapısal ve morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için ileri zaman çözümlü görüntüleme teknikleri kullanılabilir10. Ayrıca, LAL numuneleri moleküler ve biyolojik yöntemlerede uygundur 19,28. Tablo 1’de, LAL modeli sonuçlarının kullanıldığı örnek çalışmalar verilmiştir. Bu kapsamda HH20-21’e ulaşan civciv embriyolarına LAL müdahalesi yapıldı. Hem kontrol (sağlıklı…

Discussion

HLHS’de, yapısal kusurlar nedeniyle kan akışı değişir ve sol tarafta anormal morfolojiye yol açar 4,6. Mevcut model, HLHS’nin ilerlemesini daha iyi anlamak için pratik bir deneysel sistem sağlar ve hatta patogenezinitaklit edebilir 8. Bununla birlikte, klinik olarak tamamen eşdeğer bir HLHS hayvan modeli oluşturmak zorlu bir iştir. Burada sunulan kuş LAL modeline ek olarak, farelerde, fetal koyunlarda ve kurbağalarda yapıla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tübitak 2247A Baş Araştırmacı Ödülü 120C139’a fon sağlamayı kabul ediyoruz. Yazarlar ayrıca PakTavuk Gıda’ya da teşekkür eder. ve Tic. A.Ş., İstanbul, Türkiye, döl verimi sağlamak ve kardiyovasküler araştırmaları desteklemek için.

Materials

10-0 nylon surgical suture Ethicon
Elastica van Gieson staining kit Sigma-Aldrich 115974 For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute Interlab 64-17-5 For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A AZYSS600-110
Kimwipes Interlab 080.65.002
Microscissors World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 555640S Vannas STR 82 mm
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk Leica Biosystems  39602012 Tissue embedding medium
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508  Stemi 508 Used at station 1
Stereo Microscope Zeiss Stemi 2000-C Stemi 2000-C Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) Adumont & Fils, Switzerland Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)  World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 501985 Used to remove the membranes on the embryo
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
  2. Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
  3. Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
  4. Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
  5. Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
  6. Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
  7. Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
  8. Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
  9. Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
  10. Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
  11. Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
  12. Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
  13. Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
  14. Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
  15. Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
  16. Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
  17. Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
  18. Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
  19. Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
  20. Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
  21. Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
  22. Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
  23. Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
  24. Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
  25. Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
  26. Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
  27. Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
  28. Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
  29. Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
  30. Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
  31. Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
  32. Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
  33. Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
  34. Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
  35. Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
  36. Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
  37. Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
  38. Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
  39. Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
  40. Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).

Tags

Keywords: Left Atrial LigationAvian EmbryoHemodynamic LoadingVascular DevelopmentVentricular StructureHypoplastic Left Heart SyndromeMechanical InterventionMicroscopic Surgical TechniquesCardiovascular Development
check_url/65330?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas, F., Pekkan, K. Left Atrial Ligation in the Avian Embryo as a Model for Altered Hemodynamic Loading During Early Vascular Development. J. Vis. Exp. (196), e65330, doi:10.3791/65330 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image