Universell molekylär retention med 11-faldig expansionsmikroskopi
Summary
Här presenteras en ny version av expansionsmikroskopi (ExM), Magnify, som är modifierad för upp till 11-faldig expansion, bevarar ett omfattande utbud av biomolekylklasser och är kompatibel med ett brett spektrum av vävnadstyper. Det möjliggör undersökning av nanoskala konfiguration av biomolekyler med hjälp av konventionella diffraktionsbegränsade mikroskop.
Abstract
Nanoskala avbildning av biologiska prover kan förbättra förståelsen av sjukdomspatogenes. Under de senaste åren har expansionsmikroskopi (ExM) visat sig vara ett effektivt och billigt alternativ till optisk superupplösningsmikroskopi. Det har dock begränsats av behovet av specifika och ofta anpassade förankringsmedel för att behålla olika biomolekylklasser i gelén och av svårigheter med att expandera kliniska standardprovformat, såsom formalinfixerad paraffininbäddad vävnad, särskilt om större expansionsfaktorer eller konserverade proteinepitoper önskas. Här beskriver vi Magnify, en ny ExM-metod för robust expansion upp till 11 gånger i ett brett spektrum av vävnadstyper. Genom att använda metakrolein som kemiskt ankare mellan vävnaden och gelen behåller Magnify flera biomolekyler, såsom proteiner, lipider och nukleinsyror, i gelén, vilket möjliggör en bred nanoskala avbildning av vävnader på konventionella optiska mikroskop. Detta protokoll beskriver bästa praxis för att säkerställa robust och sprickfri vävnadsexpansion, samt tips för hantering och avbildning av mycket expanderade geler.
Introduction
Biologiska system uppvisar strukturell heterogenitet, från lemmarna och organen ner till nivåerna av proteiner på nanoskalan. Därför kräver en fullständig förståelse av driften av dessa system visuell undersökning över dessa storleksskalor. Diffraktionsgränsen för ljus orsakar dock utmaningar vid visualisering av strukturer mindre än ~ 200-300 nm på ett konventionellt fluorescensmikroskop. Dessutom presenterar optiska superupplösningsmetoder 1,2,3, såsom stimulerad emissionsutarmning (STED), fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) och strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), även om de är kraftfulla, sina egna utmaningar, eftersom de kräver dyr hårdvara och reagens och ofta har långsamma förvärvstider och dålig förmåga att avbilda stora volymer i 3D.
Expansionsmikroskopi4 (ExM) ger ett alternativt sätt att kringgå diffraktionsgränsen för ljus genom att kovalent förankra biomolekyler i en vattensvällbar polymergel och fysiskt dra isär dem, vilket gör dem lösbara på konventionella optiska mikroskop. En mängd ExM-protokollvarianter har utvecklats sedan den ursprungliga publiceringen av ExM för mindre än ett decennium sedan, och dessa protokoll tillåter direkt införlivande av proteiner 5,6,7, RNA 8,9,10 eller lipider11,12,13 in i gelnätverket genom att ändra det kemiska ankaret eller expandera provet ytterligare (vilket förbättrar den effektiva upplösningen) antingen i ett enda steg14 eller flera iterativa steg15,16. Fram till nyligen kunde inget enda ExM-protokoll behålla dessa tre biomolekylklasser med ett enda kommersiellt tillgängligt kemiskt ankare samtidigt som det gav en mekaniskt robust gel som kunde expandera ~ 10 gånger i en enda expansionsrunda.
Här presenterar vi Magnify17, ett nytt tillskott till ExM-arsenalen som använder metakrolein som biomolekylankare. Metakrolein bildar kovalenta bindningar med vävnad som paraformaldehyd, vilket säkerställer att flera klasser av biomolekyler kan behållas inom gelnätverket utan att kräva olika specifika eller anpassade förankringsmedel. Dessutom kan denna teknik expandera ett brett spektrum av vävnader upp till 11 gånger, inklusive notoriskt utmanande prover såsom formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) kliniska prover. Tidigare metoder för att expandera sådana mekaniskt styva prover krävde hård proteassmältning, vilket gjorde antikroppsmärkning av proteiner av intresse omöjlig efter att provet hade expanderats. Däremot uppnår denna teknik expansionen av FFPE-kliniska prover med användning av en het denatureringslösning, vilket bevarar hela proteinepitoper i gelén, som kan riktas mot bildbehandling efter expansion (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi Magnify-protokollet 17, en ExM-variant som kan behålla flera biomolekyler med ett enda kemiskt ankare och expandera utmanande FFPE-kliniska prover upp till11 gånger med värmedenaturering. De viktigaste förändringarna i detta protokoll som skiljer det från andra ExM-protokoll inkluderar användningen av en omformulerad gel som förblir mekaniskt robust även när den är helt expanderad, liksom användningen av metakrolein som biomolekylankare. De mest kritiska stegen i de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Carnegie Mellon University och D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. och X.R.), National Institutes of Health (N.I.H.) Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01 och Kauffman Foundation.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
