11 Katlı Genişleme Mikroskobu ile Üniversal Moleküler Retansiyon
Summary
Burada, 11 kata kadar genişleme için modifiye edilmiş, kapsamlı bir biyomolekül sınıfı dizisini koruyan ve çok çeşitli doku tipleriyle uyumlu olan genişleme mikroskobunun (ExM) yeni bir versiyonu olan Magnify sunulmaktadır. Konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanılarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun sorgulanmasını sağlar.
Abstract
Biyolojik örneklerin nano ölçekli görüntülenmesi, hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Son yıllarda, genleşme mikroskobunun (ExM) optik süper çözünürlüklü mikroskopiye etkili ve düşük maliyetli bir alternatif olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, jel içinde farklı biyomolekül sınıflarını tutmak için spesifik ve genellikle özel ankraj ajanlarına duyulan ihtiyaç ve özellikle daha büyük genişleme faktörleri veya korunmuş protein epitopları isteniyorsa, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku gibi standart klinik numune formatlarının genişletilmesindeki zorluklarla sınırlandırılmıştır. Burada, çok çeşitli doku tiplerinde 11 kata kadar sağlam genişleme için yeni bir ExM yöntemi olan Magnify’ı açıklıyoruz. Magnify, doku ve jel arasındaki kimyasal çapa olarak metakrolein kullanarak, jel içinde proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi çoklu biyomolekülleri tutar ve böylece dokuların geleneksel optik mikroskoplarda geniş nano ölçekli görüntülenmesine olanak tanır. Bu protokol, sağlam ve çatlaksız doku genişlemesini sağlamak için en iyi uygulamaları ve ayrıca yüksek oranda genişlemiş jellerin işlenmesi ve görüntülenmesi için ipuçlarını açıklar.
Introduction
Biyolojik sistemler, uzuvlardan ve organlardan nano ölçekteki protein seviyelerine kadar yapısal heterojenlik sergiler. Bu nedenle, bu sistemlerin çalışmasının tam olarak anlaşılması, bu boyut ölçeklerinde görsel inceleme gerektirir. Bununla birlikte, ışığın kırınım sınırı, geleneksel bir floresan mikroskobunda ~200-300 nm’den daha küçük yapıların görselleştirilmesinde zorluklara neden olur. Ek olarak, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED), foto-aktif lokalizasyon mikroskobu (PALM), stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) gibi optik süper çözünürlük yöntemleri 1,2,3, güçlü olmalarına rağmen, pahalı donanım ve reaktifler gerektirdiğinden ve genellikle yavaş edinim sürelerine ve büyük hacimleri 3D olarak görüntüleme konusunda zayıf bir yeteneğe sahip olduklarından kendi zorluklarını ortaya koymaktadır.
Genleşme mikroskobu4 (ExM), biyomolekülleri suda şişebilen bir polimer jele kovalent olarak sabitleyerek ve fiziksel olarak ayırarak ışığın kırınım sınırını aşmanın alternatif bir yolunu sunar, böylece geleneksel optik mikroskoplarda çözülebilir hale getirir. On yıldan daha kısa bir süre önce ExM’nin orijinal yayınlanmasından bu yana çok sayıda ExM protokol varyantı geliştirilmiştir ve bu protokoller,proteinlerin 5,6,7, RNA 8,9,10 veya lipitlerin11,12,13 doğrudan dahil edilmesine izin verir kimyasal ankrajı değiştirerek veya numuneyi daha da genişleterek (böylece etkili çözünürlüğü iyileştirerek) tek bir adımda14 veya çoklu yinelemeli adımlarda15,16 jel ağına. Yakın zamana kadar, tek bir ExM protokolü, tek bir genişleme turunda ~ 10 kat genişleyebilen mekanik olarak sağlam bir jel sağlarken, ticari olarak temin edilebilen tek bir kimyasal çapa ile bu üç biyomolekül sınıfını koruyamadı.
Burada, biyomolekül çapası olarak metakrolein kullanan ExM cephaneliğine yeni eklenen Magnify17’yi sunuyoruz. Metakrolein, paraformaldehit gibi doku ile kovalent bağlar oluşturarak, çeşitli spesifik veya özel ankraj ajanları gerektirmeden jel ağı içinde birden fazla biyomolekül sınıfının tutulabilmesini sağlar. Ek olarak, bu teknik, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) klinik numuneler gibi zorlu numuneler de dahil olmak üzere geniş bir doku yelpazesini 11 kata kadar genişletebilir. Bu tür mekanik olarak sert numuneleri genişletmek için önceki yöntemler, sert proteaz sindirimi gerektiriyordu ve bu da numune genişletildikten sonra ilgilenilen proteinlerin antikor etiketlemesini imkansız hale getiriyordu. Buna karşılık, bu teknik, sıcak denatüre edici bir çözelti kullanarak FFPE klinik örneklerinin genişletilmesini sağlar, böylece genişleme sonrası görüntüleme için hedeflenebilen jel içindeki tüm protein epitoplarını korur (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, tek bir kimyasal ankraj ile birden fazla biyomolekülü tutabilen ve ısı denatürasyonu ile zorlu FFPE klinik örneklerini11 kata kadar genişletebilen bir ExM varyantı olan Magnify protokolünü sunuyoruz. Bu protokolü diğer ExM protokollerinden ayıran temel değişiklikler, tamamen genişletildiğinde bile mekanik olarak sağlam kalan yeniden formüle edilmiş bir jelin kullanımını ve ayrıca biyomolekül çapası olarak metakrolein kullanımını içerir. Bu protokoldeki en kri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Carnegie Mellon Üniversitesi ve DSF Yardım Vakfı (YZ ve XR), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir. Yönetmenin Yeni Yenilikçi Ödülü DP2 OD025926-01 ve Kauffman Vakfı.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
