Her præsenterer vi en protokol til generering af rottetarmorganoider og bruger dem i flere downstream-applikationer. Rotter er ofte en foretrukken præklinisk model, og det robuste tarmorganoidsystem udfylder behovet for et in vitro-system til at ledsage in vivo-undersøgelser .
Når du bruger organoider til at vurdere fysiologi og celleskæbnebeslutninger, er det vigtigt at bruge en model, der nøje rekapitulerer in vivo-sammenhænge . Derfor anvendes patientafledte organoider til sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og personlig behandlingsscreening. Musens tarmorganoider bruges almindeligvis til at forstå aspekter af både tarmfunktion / fysiologi og stamcelledynamik / skæbnebeslutninger. I mange sygdomssammenhænge foretrækkes rotter imidlertid ofte frem for mus som model på grund af deres større fysiologiske lighed med mennesker med hensyn til sygdomspatofysiologi. Rottemodellen har været begrænset af mangel på genetiske værktøjer til rådighed in vivo, og rottetarmorganoider har vist sig skrøbelige og vanskelige at dyrke på lang sigt. Her bygger vi videre på tidligere offentliggjorte protokoller for robust at generere rottetarmorganoider fra tolvfingertarmen og jejunum. Vi giver et overblik over flere downstream-applikationer, der bruger rottetarmorganoider, herunder funktionelle hævelsesanalyser, helmonteret farvning, generering af 2D enteroide monolag og lentiviral transduktion. Rotteorganoidmodellen giver en praktisk løsning på feltets behov for en in vitro-model , der bevarer fysiologisk relevans for mennesker, hurtigt kan genmanipuleres og let opnås uden de barrierer, der er involveret i anskaffelse af humane tarmorganoider.
Den menneskelige tyndtarmepitelarkitektur og cellulære sammensætning er komplekse, hvilket afspejler deres fysiologiske funktioner. Tyndtarmens primære rolle er at absorbere næringsstoffer fra mad, der passerer gennem dens lumen1. For at maksimere denne funktion er tarmoverfladen organiseret i fingerlignende fremspring kaldet villi, som øger det absorberende overfladeareal og koplignende invaginationer kaldet krypter, som huser og isolerer stamcellerne. Inden for epitelet genereres forskellige specialiserede absorberende og sekretoriske celletyper for at udføre forskellige funktioner1. På grund af denne kompleksitet har det været vanskeligt at modellere væv som tarmen i høje passagetransformerede udødeliggjorte cellelinjer. Undersøgelsen af stamceller, især voksne stamceller og deres differentieringsmekanismer, har imidlertid muliggjort udviklingen af 3D intestinale organoidkulturer. Brugen af organoidmodeller har transformeret feltet, dels på grund af deres rekapitulation af nogle arkitektoniske komponenter og celletypeheterogenitet, der findes i den intakte tarm. Intestinale organoider kan dyrkes på lang sigt in vitro på grund af vedligeholdelsen af den aktive stamcellepopulation2.
Tarmorganoider er hurtigt blevet en tilpasningsdygtig model til at studere stamcellebiologi, cellefysiologi, genetisk sygdom og ernæring 3,4 samt et værktøj til at udvikle nye lægemiddelleveringsmetoder5. Derudover anvendes patientafledte organoider til sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og personlig behandlingsscreening, blandt andet 6,7,8,9. Imidlertid udgør menneskelige tarmorganoider stadig udfordringer. Vævstilgængelighed, krav til godkendelse fra Institutional Review Board og etiske spørgsmål begrænser den udbredte anvendelse af humane prøver. Derudover kræver humane tarmorganoider genereret fra tarmkrypter to forskellige dyrkningsbetingelser for vedligeholdelse af udifferentierede stamceller eller for at inducere differentiering af modne celletyper10. Dette står i kontrast til in vivo, hvor stamceller og modne differentierede celletyper er til stede samtidigt og kontinuerligt genereres/vedligeholdes1. På den anden side kræver musens tarmorganoider, der dyrkes i en mindre kompleks cocktail af vækstfaktorer, ikke dette skift i mediesammensætning og kan opretholde stamceller og differentierede celler i samme mediekontekst 2,11. Imidlertid kan nøgleforskelle i musetarm sammenlignet med mennesker gøre museorganoider til en suboptimal model i mange tilfælde. Samlet set er mange tarmorganoider fra større pattedyr, herunder heste, svin, får, køer, hunde og katte, med succes blevet genereret under dyrkningsforhold, der er tættere på linje med musetarmorganoider end dyrkningsbetingelserne for humane tarmorganoider12. Forskellene i vækstfaktorbetingelser mellem mus og humane organoider afspejler sandsynligvis forskelle i stamcellenichesammensætning og forskellige krav til stamcelleoverlevelse, spredning og vedligeholdelse. Derfor er der behov for et let tilgængeligt modelorganoidsystem, der 1) ligner menneskets tarmcellesammensætning, 2) indeholder stamceller med vækstfaktorkrav som humane tarmorganoider, og 3) er i stand til kontinuerligt at opretholde udifferentierede og differentierede rum. Ideelt set ville systemet være fra en almindeligt anvendt præklinisk dyremodel, således at in vivo– og in vitro-forsøg kan korreleres og anvendes sammen.
Rotter er en almindeligt anvendt præklinisk model til tarmfysiologi og farmakologiske undersøgelser på grund af deres meget lignende tarmfysiologi og biokemi som mennesker13, især med hensyn til tarmpermeabilitet14. Deres relativt større størrelse sammenlignet med mus gør dem mere modtagelige for kirurgiske procedurer. Mens store dyremodeller, herunder svin, undertiden bruges, er rotter en mere overkommelig model, kræver mindre plads til husdyrhold og har let kommercielt tilgængelige standardstammer15. En ulempe ved at bruge rottemodeller er, at den genetiske værktøjskasse til in vivo-undersøgelser ikke er veludviklet sammenlignet med mus, og genereringen af nye rottelinjer, herunder knockouts, knock-ins og transgener, er ofte omkostningsuoverkommelig. Udvikling og optimering af en robust tarmorganoidmodel med rotter vil muliggøre genetisk manipulation, farmakologiske behandlinger og undersøgelser med højere gennemstrømning i en tilgængelig model, der bevarer vigtig fysiologisk relevans for mennesker. Imidlertid er fordelene ved en gnaverorganoidmodel versus en anden stærkt afhængig af den særlige proces eller det gen, der undersøges; Visse gener, der findes hos mennesker, kan være pseudogener hos mus, men ikke rotter16,17. Derudover afsløres artsspecifikke celleundertyper i stigende grad af enkeltcelle RNAseq18,19,20. Endelig viser tarmsygdomsmodeller hos rotter og mus ofte betydelige variationer i fænotype21,22, således at den model, der i højere grad rekapitulerer symptomerne og sygdomsprocessen hos mennesker, skal vælges til downstream-arbejde. Genereringen af en rottetarmorganoidmodel giver forskerne yderligere fleksibilitet og valgmuligheder med hensyn til at vælge et modelsystem, der passer bedst til deres omstændigheder. Her udvides eksisterende protokoller23,24 til generering af rottetarmorganoider, og der skitseres en protokol for generering og vedligeholdelse af rottetarmorganoider fra tolvfingertarmen eller jejunum. Desuden, flere downstream applikationer, herunder lentiviral infektion, hele mount farvning, og forskolin hævelse assays, er beskrevet.
Udviklingen af en rotte intestinal organoid model bevarer vigtige funktionelle egenskaber, der findes i organet in vivo og er et lovende værktøj til præklinisk testning, lægemiddelscreening og funktionelle assays. Denne in vitro-model kan anvendes parallelt med in vivo prækliniske gastroenterologiske undersøgelser, hvor rotter ofte er en foretrukken model på grund af deres større tarmstørrelse, delte fysiologiske aspekter med mennesker og i nogle tilfælde var bedre sygdomsmodeller38. Her skitseres en robust trin-for-trin protokol til isolering af rottetarmkrypter, generering og langsigtet kultur af rottetarmorganoider samt downstream-applikationer, herunder funktionelle forskolin-hævelsesassays, helmonteret immunofluorescens, 2D-monolagskultur og lentiviral genetisk manipulation. Rottetarmorganoider er sandsynligvis relevante i mange sygdomssammenhænge, hvor patofysiologien i musemodeller er uhensigtsmæssig og kan give en bedre model for menneskets tarmfysiologi sammenlignet med musetarmorganoider.
For at etablere langlivede organoidkulturer, der kan passeres og udvides, er det vigtigt at identificere de vigtigste vækstfaktorer, der kræves for at opretholde intestinal epitelproliferation. Musorganoider dyrkes oftest i en simpel cocktail af EGF, R-spondin og Noggin, selvom det er blevet rapporteret, at Noggin ikke er nødvendig for intestinal organoidkultur39. Konditionerede medier kan erstatte rekombinante vækstfaktorer, og de mest almindeligt anvendte cellelinjer er L-WRN, som udskiller Wnt3a, Rspondin-3 og Noggin39, L-Wnt3a og HA-Rspondin1-Fc 293T-celler40. L-WRN-konditionerede medier er tilstrækkelige til at understøtte ikke kun musetarm39 organoid vækst, men væksten af tarmorganoider fra flere husdyr og ledsagende dyr, herunder hunde, katte, kyllinger, heste, køer, får og svin12. Imidlertid er humane tarmorganoider meget forskellige i deres vækstfaktorkrav, da de kræver forskellige medieformuleringer til deres ekspansionsvækstfase (dvs. progressionen fra små til store sfæroider) versus deres differentieringsfase (dvs. generering og modning af differentierede celletyper)10. Mediekravene til rottetarmorganoider afspejler nøje ekspansionsvækstmedierne for humane tarmorganoider, men især rotteorganoider er i stand til både vækst og differentiering i dette mediemiljø, hvilket forenkler deres kulturkrav betydeligt. Mens vores indledende forsøg fokuserede på at etablere og dyrke rottetarmorganoider i L-WRN-konditionerede medier, var langvarig dyrkning spinkel, og rottetarmorganoidlinjer led af manglende robusthed (data ikke vist). Dette kan skyldes, at L-WRN-cellelinjer er konstrueret til at udskille R-spondin 3, mens 293T-Rspo1-cellelinjen, der anbefales her, er konstrueret til at udskille R-spondin 1. Det er muligt, at rotte og humane organoider foretrækker R-spondin 1, potentielt tegner sig for svigt af rotteorganoidlinjer i L-WRN-konditionerede medier.
For bedst at rekapitulere in vivo-indstillingen er det vigtigt at udvikle organoidkulturbetingelser, der muliggør stamcelleoverlevelse, vedligeholdelse og spredning, og som kan opretholde cellulær omsætning og samtidige differentieringshændelser i diskrete celletyper. Derfor skal koncentrationerne af rekombinante proteiner og/eller proteiner i konditionerede medier titreres og kontrolleres tæt for at opnå denne perfekte balance. Især er optimale Wnt-niveauer afgørende for at undgå tab af intestinale organoidkulturer. For lidt Wnt i konditionerede medier vil være ude af stand til at understøtte vækst, hvilket fører til tab af stamceller og efterfølgende organoid død; overaktivering af Wnt vil medføre, at organoider er cystiske og udifferentierede10. Selvom det ikke er detaljeret her, anbefales det kraftigt at teste hvert parti L-Wnt3a og 293T-Rspo1 konditionerede medier ved hjælp af et Wnt reporter luciferase assay, såsom en Topflash cellelinje41. Tidligere undersøgelser har beskrevet, at et optimalt parti L-Wnt3a-medier skulle resultere i en 15-fold signalforøgelse ved 12,5% og en 300-fold signalforøgelse ved 50% sammenlignet med 1% L-Wnt3a10. Da rotteorganoider er mere følsomme end museorganoider over for dyrkningskrav, især Wnt-aktiveringsniveauer, hjælper disse yderligere kvalitetskontroltrin i høj grad med at lette robustheden og pålideligheden af rotteorganoidkulturer. Da en lignende reporterlinje ikke er tilgængelig til test af Bmp-aktivitet og relative Noggin-koncentrationer i Noggin-konditionerede medier, anbefales det at bruge rekombinant Noggin, når det er muligt, for præcist at kontrollere Noggin-niveauer. Mens musens tarmorganoider kan dyrkes og vedligeholdes i fravær af Noggin39, er dette ikke blevet forsøgt for rotte intestinale organoidkulturer.
Ud over cellekulturkrav afhænger den vellykkede indledende etablering af en rotteorganoidlinje kritisk af den effektive udtømning af differentierede villi under kryptisolering. Høje niveauer af villar-forurening forårsager kryptdød, formodentlig på grund af enten signaler fra de døende celler eller sekvestrering af væsentlige faktorer. For at nedbryde disse differentierede villi fra epitelpræparater præcist og konsekvent anbefales det at udføre epitelisoleringer ved hjælp af et stereoskop. Visuel undersøgelse af epitelet, der frigives, giver et klart fingerpeg om, hvornår PBS skal kasseres og udskiftes (figur 1). Krypter bør ikke indsamles, før der er tilstrækkelig udtømning af villi. Villar-celler er terminalt differentierede og kan ikke generere organoider i kultur. Derudover kræver efterfølgende overførsel af rottetarmorganoider og deres anvendelse til enhver downstream-applikation delikat pleje. Inkubation i dissociationsreagenser i længere perioder (10 min) resulterer i signifikant celledød og tab af organoidlinjen.
Her beskrives en enkel og hurtig protokol til generering af intestinale monolag fra rotteorganoider. EME og kollagen I substrater har forskellige virkninger på epitelet, der kan udnyttes afhængigt af formålet med undersøgelsen. EME giver mulighed for hurtig og effektiv vedhæftning af enkeltceller og dannelse af cellefremspring. I modsætning hertil forsinker belægning af overfladen med kollagen I disse processer. Når monolag når ca. 80% sammenløb, begynder celler dyrket på EME at generere 3D-organoidstrukturer igen. De mangler dog tilstrækkelig fysisk og kemisk støtte til fortsat vækst. Denne tilbagevenden tilbage til organoidtilstanden kan forhindres ved at opretholde monolag i EME ved et sammenløb på 50% -80%. Tilsætningen af fortyndet EME til den apikale overflade af monolag fremmer hurtig genopretning og dannelse af de novo-organoider, hvilket genererer konvergensområder hurtigere og lettere. På en kollagen I-overflade kan celler danne et ensartet monolag og generere små klynger. Tilsætningen af kollagen I oven på monolag er imidlertid ikke tilstrækkelig til at fremkalde organoiddannelse. EME skal fortyndes ved tilsætning til monolagsoverfladen, da der vil være en stærkere mekanisk modstand for den spirende organoid at overvinde. Denne fortyndede EME tillader imidlertid ikke robust dannelse af store organoider. Alle de novo-genererede rotteorganoider, der naturligt løsner sig fra overfladen, skal straks fjernes og overføres til ufortyndet EME, så strukturel støtte og vækst kan genoprettes. På grund af organoidernes lille størrelse i dette trin anbefales passage af organoider ikke, før robust vækst er etableret. Den underliggende biologiske betydning af, hvorfor EME kan understøtte reformationen af organoider, men om kollagen I kan eller ikke kan gøre dette, er ikke klart. Der har imidlertid været rapporter om, at celler dyrket i 3D-kollagen ikke kan danne spirende organoider42,43 eller understøtte langsigtet vedligeholdelse. Kommercielt tilgængelige EME-produkter er heterogene blandinger af ekstracellulære proteiner, primært laminin og kollagen IV44. Derfor kan den særskilte sammensætning af proteiner og en epitelcelles evne til at engagere sig i den ekstracellulære matrix ved hjælp af forskellige cellulære komplekser muliggøre ombygning i EME, men ikke kollagen I. Hvorvidt kollagen I-afledte monolag kan sættes i EME for at understøtte organoid dannelse og vækst er ikke blevet testet.
Genmanipulation af rottens tarmorganoidmodel beskrives her, og protokoller for lentiviral transduktion af 3D-organoider og forbigående transfektion af 2D-monolag skitseres. For at overvinde den lave effektivitet af lentiviral organoidtransduktion blev der udviklet en protokol til forbigående transfektion af 2D-monolag. Den flade morfologi og eksponerede apikale domæner af monolag giver lettere adgang til vira og DNA-holdige komplekser. Udtrykket af en EGFP-indberetter, der anvender pLJM1-EGFP-vektoren, blev anvendt til validering af denne teknik. GFP-reporterekspression blev observeret efter 24 timer og blev opretholdt i 5-6 dage i monolag. Fremtidige undersøgelser med fokus på lentiviral transduktion af monolag vil sandsynligvis have højere effektivitet end 3D-organoidtransduktion. Ved hjælp af ovenstående protokoller kan 3D-organoider reformeres fra inficerede 2D-monolag for at lette oprettelsen af stabile linjer. Med omhu kan rottens tarmorganoidlinjer med succes opretholdes i over et år, forblive stabile over mange passager, kryopræserverede, med succes optøet og genetisk modificeret ved hjælp af lentiviral transduktion og derved imødekomme behovet for en tilgængelig og medgørlig in vitro intestinal organoidmodel, der bevarer fysiologisk relevans for mennesker.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmerne af laboratorierne Sumigray og Ameen for deres tankevækkende drøftelser. Dette arbejde blev støttet af et Charles H. Hood Foundation Child Health Grant og et Cystic Fibrosis Foundation-tilskud (004741P222) til KS og af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health til NA under tildelingsnummer 2R01DK077065-12.
3-D Culture Matrix Rat Collagen I | Cultrex/R&D Systems | 3447-020-01 | |
70 µm cell strainer | Corning/Falcon | 352350 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco/Thermo Fisher | 12634010 | |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
CryoStor | Stem Cell Technologies | 100-1061 | |
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells | R & D Systems | 3710-001-01 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes/Thermo Fisher | D1306 | |
FBS | Gibco/Thermo Fisher | 16-000-044 | |
Gastrin I (human) | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 100-0485 | |
Glutamax | Thermo Fisher | 35-050-061 | |
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free | Corning | 356231 | |
HEPES | AmericanBio | AB06021 | |
Lanolin | Beantown Chemical | 144255-250G | |
L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher | A2916801 | |
L-Wnt3a cells | ATCC | CRL-2647 | |
N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher | 17502-048 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco/Thermo Fisher | 31985070 | |
Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
pLJM1-EGFP | Addgene | 19319 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) | Sigma Aldrich | 764965 | |
p-phenylenediamine | Acros Organics/Thermo Fisher | 417481000 | |
Puromycin | VWR | J593-25mg | |
Recombinant human FGF2 protein | Peprotech | 100-18B-250ug | |
Recombinant human IGF-1 protein | Biolegend | B356441 | |
Recombinant human Noggin protein | R & D Systems | 6057-NG-100 | |
Recombinant mouse EGF protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
Sprague Dawley rat | Charles River Laboratories | Strain 001 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco/Thermo Fisher | 12604013 | |
Y27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 |