Her presenterer vi en protokoll for å generere tarmorganoider fra rotter og bruke dem i flere nedstrøms applikasjoner. Rotter er ofte en foretrukket preklinisk modell, og det robuste tarmorganoidsystemet fyller behovet for et in vitro-system som følger med in vivo-studier.
Ved bruk av organoider for å vurdere fysiologi og celleskjebnebeslutninger, er det viktig å bruke en modell som nøye rekapitulerer in vivo-sammenhenger . Følgelig brukes pasientavledede organoider til sykdomsmodellering, narkotikaforskning og personlig behandlingsscreening. Intestinale organoider fra mus brukes ofte til å forstå aspekter av både tarmfunksjon/fysiologi og stamcelledynamikk/skjebnebeslutninger. Men i mange sykdomssammenhenger foretrekkes rotter ofte fremfor mus som modell på grunn av deres større fysiologiske likhet med mennesker når det gjelder sykdomspatofysiologi. Rottemodellen har vært begrenset av mangel på genetiske verktøy tilgjengelig in vivo, og tarmorganoider fra rotter har vist seg å være skjøre og vanskelige å dyrke på lang sikt. Her bygger vi på tidligere publiserte protokoller for å robust generere tarmorganoider fra rotter fra tolvfingertarmen og jejunum. Vi gir en oversikt over flere nedstrøms applikasjoner som bruker tarmorganoider fra rotter, inkludert funksjonelle hevelsesanalyser, helmonteringsfarging, generering av 2D enteroidmonolag og lentiviral transduksjon. Rotteorganoidmodellen gir en praktisk løsning på feltets behov for en in vitro-modell som beholder fysiologisk relevans for mennesker, raskt kan manipuleres genetisk og lett oppnås uten barrierene som er involvert i anskaffelse av humane tarmorganoider.
Den menneskelige tynntarmepitelarkitekturen og cellulær sammensetning er komplekse, noe som gjenspeiler deres fysiologiske funksjoner. Tynntarmens primære rolle er å absorbere næringsstoffer fra mat som passerer gjennom lumen1. For å maksimere denne funksjonen er tarmoverflaten organisert i fingerlignende fremspring kalt villi, som øker det absorberende overflatearealet, og kopplignende invaginasjoner kalt krypter, som huser og isolerer stamceller. Innenfor epitelet genereres forskjellige spesialiserte absorberende og sekretoriske celletyper for å utføre forskjellige funksjoner1. På grunn av denne kompleksiteten har det vært vanskelig å modellere vev som tarmen i høypassasjetransformerte immortaliserte cellelinjer. Imidlertid har studien av stamceller, spesielt voksne stamceller og deres differensieringsmekanismer, tillatt utvikling av 3D intestinale organoidkulturer. Bruken av organoide modeller har forvandlet feltet, delvis på grunn av deres rekapitulering av noen arkitektoniske komponenter og celletypeheterogenitet funnet i den intakte tarmen. Intestinale organoider kan dyrkes på lang sikt in vitro på grunn av vedlikehold av den aktive stamcellepopulasjonen2.
Intestinale organoider har raskt blitt en tilpasningsdyktig modell for å studere stamcellebiologi, cellefysiologi, genetisk sykdom og ernæring3,4, samt et verktøy for å utvikle nye legemiddelleveringsmetoder5. I tillegg blir pasientavledede organoider brukt til sykdomsmodellering, narkotikaforskning og personlig behandlingsscreening, blant annet 6,7,8,9. Imidlertid gir humane tarmorganoider fortsatt utfordringer. Vevstilgjengelighet, krav til godkjenning fra Institutional Review Board og etiske problemer begrenser den utbredte bruken av menneskelige prøver. I tillegg krever humane intestinale organoider generert fra tarmkrypter to forskjellige kulturbetingelser for vedlikehold av udifferensierte stamceller eller for å indusere differensiering av modne celletyper10. Dette står i kontrast til in vivo, hvor stamceller og modne differensierte celletyper samtidig er til stede og kontinuerlig generert/vedlikeholdt1. På den annen side krever musintestinale organoider, som dyrkes i en mindre kompleks cocktail av vekstfaktorer, ikke denne bryteren i mediesammensetning og kan opprettholde stamceller og differensierte celler i samme mediekontekst 2,11. Imidlertid kan viktige forskjeller i musetarmen sammenlignet med mennesker gjøre museorganoider til en suboptimal modell i mange tilfeller. Samlet sett har mange intestinale organoider fra større pattedyr, inkludert hester, griser, sauer, kyr, hunder og katter, blitt vellykket generert i kulturforhold som er nærmere tilpasset musens intestinale organoider enn kulturbetingelsene for humane tarmorganoider12. Forskjellene i vekstfaktorforhold mellom mus og humane organoider gjenspeiler sannsynligvis forskjeller i stamcellenisjesammensetning og forskjellige krav til stamcelleoverlevelse, spredning og vedlikehold. Derfor er det behov for et lett tilgjengelig organoidsystem som 1) ligner på human tarmcellesammensetning, 2) inneholder stamceller med vekstfaktorkrav som for humane tarmorganoider, og 3) er i stand til kontinuerlig å opprettholde udifferensierte og differensierte rom. Ideelt sett vil systemet være fra en vanlig brukt preklinisk dyremodell, slik at in vivo og in vitro-eksperimenter kan korreleres og brukes sammen.
Rotter er en vanlig brukt preklinisk modell for studier av tarmfysiologi og farmakologi på grunn av deres svært like tarmfysiologi og biokjemi som mennesker13, spesielt med hensyn til intestinal permeabilitet14. Deres relativt større størrelse sammenlignet med mus gjør dem mer mottagelige for kirurgiske prosedyrer. Mens store dyremodeller, inkludert griser, noen ganger brukes, er rotter en rimeligere modell, krever mindre plass til husdyrhold, og har lett tilgjengelige standardstammer15. En ulempe ved å bruke rottemodeller er at den genetiske verktøykassen for in vivo-studier ikke er godt utviklet sammenlignet med mus, og genereringen av nye rottelinjer, inkludert knockouts, knock-ins og transgenics, er ofte kostnadsoverkommelig. Utviklingen og optimaliseringen av en robust tarmorganoidmodell for rotter vil tillate genetisk manipulasjon, farmakologiske behandlinger og høyere gjennomstrømningsstudier i en tilgjengelig modell som beholder viktig fysiologisk relevans for mennesker. Fordelene ved en gnagerorganoidmodell kontra en annen er imidlertid svært avhengig av den spesielle prosessen eller genet som studeres; Visse gener som finnes hos mennesker kan være pseudogener hos mus, men ikke rotter16,17. I tillegg blir artsspesifikke cellesubtyper i økende grad avduket av encellet RNAseq18,19,20. Endelig viser tarmsykdomsmodeller fra rotter og mus ofte betydelige variasjoner i fenotyper21,22 slik at modellen som i større grad rekapitulerer symptomene og sykdomsprosessen sett hos mennesker, må velges for nedstrøms arbeid. Genereringen av en rottetarmorganoidmodell gir ekstra fleksibilitet og valg for forskere ved å velge et modellsystem som passer best for deres omstendigheter. Her utvides eksisterende protokoller23,24 for generering av tarmorganoider fra rotter, og en protokoll er skissert for generering og vedlikehold av tarmorganoider fra rotter fra tolvfingertarmen eller jejunum. I tillegg er flere nedstrøms applikasjoner, inkludert lentiviral infeksjon, helmonteringsfarging og forskolin hevelsesanalyser, beskrevet.
Utviklingen av en tarmorganoidmodell hos rotter bevarer viktige funksjonelle egenskaper som finnes i organet in vivo og er et lovende verktøy for preklinisk testing, legemiddelscreening og funksjonelle analyser. Denne in vitro-modellen kan brukes parallelt med in vivo prekliniske gastroenterologistudier, hvor rotter ofte er en foretrukket modell på grunn av deres større tarmstørrelse, delte fysiologiske aspekter med mennesker, og i noen tilfeller er bedre sykdomsmodeller38. Her er en robust trinnvis protokoll for isolering av tarmkrypter fra rotter, generering og langsiktig kultur av tarmorganoider fra rotter, samt nedstrøms applikasjoner, inkludert funksjonelle forskolin hevelsesanalyser, hele mount immunfluorescens, 2D monolagskultur og lentiviral genetisk manipulasjon skissert. Intestinale organoider fra rotter er sannsynligvis relevante i mange sykdomssammenhenger der patofysiologien til musemodeller er uhensiktsmessig og kan gi en bedre modell for human tarmfysiologi sammenlignet med intestinale organoider fra mus.
For å etablere langlivede organoidkulturer som kan passeres og utvides, er det viktig å identifisere de viktigste vekstfaktorene som kreves for å opprettholde intestinal epitelial spredning. Museorganoider dyrkes oftest i en enkel cocktail av EGF, R-spondin og Noggin, selv om det har blitt rapportert at Noggin ikke er nødvendig for intestinal organoidkultur39. Betingede medier kan erstatte rekombinante vekstfaktorer, og de mest brukte cellelinjene er L-WRN, som utskiller Wnt3a, Rspondin-3 og Noggin39, L-Wnt3a og HA-Rspondin1-Fc 293T-celler40. L-WRN betingede medier er tilstrekkelig til å støtte ikke bare mus intestinal39 organoid vekst, men veksten av intestinale organoider fra flere husdyr og følgesvenner, inkludert hunder, katter, kyllinger, hester, kyr, sauer og griser12. Imidlertid er humane intestinale organoider svært forskjellige i deres vekstfaktorkrav, da de krever forskjellige medieformuleringer for deres ekspansjonsvekstfase (dvs. progresjonen fra små til store sfæroider) versus deres differensieringsfase (dvs. generering og modning av differensierte celletyper)10. Mediekravene til tarmorganoider fra rotter speiler nøye ekspansjonsvekstmediene for humane tarmorganoider, men spesielt er rotteorganoider i stand til både vekst og differensiering i dette mediemiljøet, noe som forenkler deres kulturkrav betydelig. Mens våre første forsøk fokuserte på å etablere og dyrke tarmorganoider fra rotter i L-WRN-betingede medier, var langsiktig kultur spinkel, og rottetarmorganoidlinjer led av mangel på robusthet (data ikke vist). Dette kan skyldes at L-WRN-cellelinjer er konstruert for å skille ut R-spondin 3, mens 293T-Rspo1-cellelinjen som anbefales her, er konstruert for å skille ut R-spondin 1. Det er mulig at rotter og humane organoider foretrekker R-spondin 1, noe som potensielt kan føre til svikt i rotteorganoide linjer i L-WRN-betingede medier.
For å rekapitulere in vivo-innstillingen nærmest, er det viktig å utvikle organoidkulturbetingelser som muliggjør stamcelleoverlevelse, vedlikehold og spredning, og som kan opprettholde cellulær omsetning og samtidige differensieringshendelser i diskrete celletyper. Derfor må konsentrasjonene av rekombinante proteiner og/eller proteiner i betingede medier titreres og kontrolleres tett for å oppnå denne perfekte balansen. Spesielt er optimale Wnt-nivåer avgjørende for å unngå tap av intestinale organoidkulturer. For lite Wnt i betingede medier vil ikke være i stand til å støtte vekst, noe som fører til tap av stamceller og påfølgende organoid død; overaktivering av Wnt vil føre til at organoider blir cystiske og udifferensierte10. Selv om det ikke er beskrevet her, anbefales det sterkt å teste hver batch av L-Wnt3a og 293T-Rspo1 betingede medier ved hjelp av en Wnt reporter luciferase-analyse, for eksempel en Topflash-cellelinje41. Tidligere studier har beskrevet at et optimalt parti av L-Wnt3a-medier bør resultere i en 15 ganger signaløkning ved 12,5% og en 300 ganger signaløkning ved 50%, sammenlignet med 1% L-Wnt3a10. Siden rotteorganoider er mer følsomme enn museorganoider for kulturkrav, spesielt Wnt-aktiveringsnivåer, bidrar disse ekstra kvalitetskontrolltrinnene sterkt til å lette robustheten og påliteligheten til rotteorganoidkulturer. Fordi en lignende reporterlinje ikke er tilgjengelig for testing av Bmp-aktivitet og relative Noggin-konsentrasjoner i Noggin-kondisjonerte medier, anbefales det å bruke rekombinant Noggin når det er mulig for å nøyaktig kontrollere Noggin-nivåer. Mens mus intestinale organoider kan dyrkes og vedlikeholdes i fravær av Noggin39, har dette ikke blitt forsøkt for rotte intestinal organoid kulturer.
Utover cellekulturkrav, avhenger den vellykkede første etableringen av en rotteorganoidlinje kritisk av effektiv uttømming av differensierte villi under kryptisolasjon. Høye nivåer av villar-forurensning forårsaker kryptdød, antagelig på grunn av enten signaler fra de døende cellene eller sekvestrering av viktige faktorer. For å tømme disse differensierte villi fra epitelpreparater nøyaktig og konsekvent, anbefales det å utføre epitelisolasjoner ved hjelp av et stereoskop. Visuell undersøkelse av epitelet som frigjøres, gir et klart signal om når PBS skal kastes og erstattes (figur 1). Krypter bør ikke samles inn før det er tilstrekkelig uttømming av villi. Villar-celler er terminalt differensiert og kan ikke generere organoider i kultur. I tillegg krever etterfølgende passering av tarmorganoider fra rotter og deres bruk for enhver nedstrøms applikasjon delikat pleie. Inkubasjon i dissosiasjonsreagenser i lengre perioder (10 min) resulterer i signifikant celledød og tap av organoidlinjen.
Her beskrives en enkel og rask protokoll for generering av intestinale monolayers fra rotteorganoider. EME- og kollagen I-substrater har forskjellige effekter på epitelet, som kan utnyttes avhengig av formålet med studien. EME muliggjør rask og effektiv adhesjon av enkeltceller og dannelse av celleprojeksjoner. I motsetning til dette forsinker belegg overflaten med kollagen I disse prosessene. Når monolayers når omtrent 80% sammenløp, begynner celler dyrket på EME å generere 3D-organoidstrukturer igjen. Imidlertid mangler de tilstrekkelig fysisk og kjemisk støtte for fortsatt vekst. Denne tilbakevendingen tilbake til organoid tilstand kan forhindres ved å opprettholde monolayers i EME ved en konfluens på 50% -80%. Tilsetningen av fortynnet EME til den apikale overflaten av monolayers fremmer rask gjenoppretting og dannelse av de novo-organoider, og genererer konvergensregioner raskere og lettere. På en kollagen I-overflate kan celler danne et jevnt monolag og generere små klynger. Imidlertid er tilsetningen av kollagen I på toppen av monolayers ikke tilstrekkelig til å indusere organoiddannelse. EME må fortynnes når det legges til monolagsoverflaten, da det vil være en sterkere mekanisk motstand for den gryende organoiden å overvinne. Denne fortynnede EME tillater imidlertid ikke robust dannelse av store organoider. Alle de novo-genererte rotteorganoider som naturlig løsner fra overflaten, må umiddelbart fjernes og overføres til ufortynnet EME slik at strukturell støtte og vekst kan gjenopprettes. På grunn av den lille størrelsen på organoidene i dette trinnet, anbefales ikke passasje av organoider før robust vekst er etablert. Den underliggende biologiske betydningen av hvorfor EME kan støtte reformasjonen av organoider, men om kollagen kan eller ikke kan gjøre dette, er ikke klart. Imidlertid har det vært rapporter om at celler dyrket i 3D-kollagen ikke kan danne budded organoider42,43 eller støtte langsiktig vedlikehold. Kommersielt tilgjengelige EME-produkter er heterogene blandinger av ekstracellulære proteiner, primært laminin og kollagen IV44. Derfor kan den distinkte sammensetningen av proteiner og evnen til en epitelcelle til å engasjere seg med den ekstracellulære matrisen ved hjelp av forskjellige cellulære komplekser tillate remodellering i EME, men ikke kollagen I. Hvorvidt kollagen I-avledede monolayers kan settes inn i EME for å støtte organoiddannelse og vekst har ikke blitt testet.
Genetisk manipulering av rottetarmorganoidmodellen er beskrevet her, og protokoller for lentiviral transduksjon av 3D-organoider og forbigående transfeksjon av 2D-monolag er skissert. For å overvinne den lave effektiviteten av lentiviral organoid transduksjon ble det utviklet en protokoll for forbigående transfeksjon av 2D monolayers. Den flate morfologien og eksponerte apikale domener av monolayers gir lettere tilgang til virus og DNA-holdige komplekser. Uttrykket av en EGFP-reporter som bruker pLJM1-EGFP-vektoren ble brukt til validering av denne teknikken. GFP-reporteruttrykk ble observert etter 24 timer, og ble opprettholdt i 5-6 dager i monolag. Fremtidige studier som fokuserer på lentiviviral transduksjon av monolayers vil sannsynligvis ha høyere effektivitet enn 3D organoid transduksjon. Ved hjelp av protokollene ovenfor kan 3D-organoider reformeres fra infiserte 2D-monolag for å lette opprettelsen av stabile linjer. Med forsiktighet kan rottetarmorganoidlinjer opprettholdes i over et år, forbli stabile over mange passasjer, kryopreservert, vellykket tint og genetisk modifisert ved hjelp av lentiviviral transduksjon, og dermed adressere behovet for en tilgjengelig og håndterbar in vitro intestinal organoidmodell som beholder fysiologisk relevans for mennesker.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av Sumigray og Ameen laboratorier for deres gjennomtenkte diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av et Charles H. Hood Foundation Child Health Grant og et Cystic Fibrosis Foundation-stipend (004741P222) til KS og av National Institute of Diabetes og fordøyelses- og nyresykdommer fra National Institutes of Health til NA under tildelingsnummer 2R01DK077065-12.
3-D Culture Matrix Rat Collagen I | Cultrex/R&D Systems | 3447-020-01 | |
70 µm cell strainer | Corning/Falcon | 352350 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco/Thermo Fisher | 12634010 | |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
CryoStor | Stem Cell Technologies | 100-1061 | |
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells | R & D Systems | 3710-001-01 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes/Thermo Fisher | D1306 | |
FBS | Gibco/Thermo Fisher | 16-000-044 | |
Gastrin I (human) | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 100-0485 | |
Glutamax | Thermo Fisher | 35-050-061 | |
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free | Corning | 356231 | |
HEPES | AmericanBio | AB06021 | |
Lanolin | Beantown Chemical | 144255-250G | |
L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher | A2916801 | |
L-Wnt3a cells | ATCC | CRL-2647 | |
N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher | 17502-048 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco/Thermo Fisher | 31985070 | |
Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
pLJM1-EGFP | Addgene | 19319 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) | Sigma Aldrich | 764965 | |
p-phenylenediamine | Acros Organics/Thermo Fisher | 417481000 | |
Puromycin | VWR | J593-25mg | |
Recombinant human FGF2 protein | Peprotech | 100-18B-250ug | |
Recombinant human IGF-1 protein | Biolegend | B356441 | |
Recombinant human Noggin protein | R & D Systems | 6057-NG-100 | |
Recombinant mouse EGF protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
Sprague Dawley rat | Charles River Laboratories | Strain 001 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco/Thermo Fisher | 12604013 | |
Y27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 |