उनकी सरल शारीरिक रचना को देखते हुए, एनोफिलीज वृषण शुक्राणुजनन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा साइटोलॉजिकल मॉडल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल सीटू संकरण में पूरे-माउंट प्रतिदीप्ति का वर्णन करता है, इस जैविक प्रक्रिया की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक तकनीक, साथ ही शुक्राणु उत्पादन में शामिल जीन में उत्परिवर्तन को परेशान करने वाले ट्रांसजेनिक उपभेदों के फेनोटाइप।
शुक्राणुजनन एक जटिल जैविक प्रक्रिया है जिसके दौरान द्विगुणित कोशिकाएं क्रमिक माइटोटिक और मियोटिक विभाजन से गुजरती हैं, जिसके बाद अगुणित शुक्राणु बनाने के लिए बड़े संरचनात्मक परिवर्तन होते हैं। जैविक पहलू के अलावा, जीन ड्राइव और सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृतियों जैसी आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों को समझने और विकसित करने के लिए शुक्राणुजनन का अध्ययन करना सबसे महत्वपूर्ण है, जो क्रमशः मेंडेलियन वंशानुक्रम और शुक्राणु लिंग अनुपात को बदलकर, कीट कीट आबादी को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ये प्रौद्योगिकियां प्रयोगशाला सेटिंग्स में बहुत आशाजनक साबित हुई हैं और संभावित रूप से एनोफिलीज मच्छरों की जंगली आबादी को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो मलेरिया के वैक्टर हैं। वृषण शरीर रचना विज्ञान की सादगी और उनके चिकित्सा महत्व के कारण, उप-सहारा अफ्रीका में एक प्रमुख मलेरिया वेक्टर एनोफिलीज गैम्बिया, शुक्राणुजनन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा साइटोलॉजिकल मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। यह प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे पूरे माउंट फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (डब्ल्यूफिश) का उपयोग फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके शुक्राणुजनन के माध्यम से सेल परमाणु संरचना में नाटकीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो विशेष रूप से एक्स और वाई क्रोमोसोम को दाग देते हैं। फिश को आमतौर पर माइटोटिक या मियोटिक क्रोमोसोम को उजागर करने के लिए प्रजनन अंगों के विघटन की आवश्यकता होती है और फ्लोरोसेंट जांच के साथ विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों के धुंधला होने की अनुमति मिलती है। डब्ल्यूफिश टेस्टिस की मूल साइटोलॉजिकल संरचना के संरक्षण को सक्षम बनाता है, जो दोहराए जाने वाले डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करने वाले फ्लोरोसेंट जांच से सिग्नल का पता लगाने के अच्छे स्तर के साथ युग्मित होता है। यह शोधकर्ताओं को अंग की संरचना के साथ अर्धसूत्रीविभाजन से गुजरने वाली कोशिकाओं के क्रोमोसोमल व्यवहार में परिवर्तन का पालन करने की अनुमति देता है, जहां प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को स्पष्ट रूप से अलग किया जा सकता है। यह तकनीक विशेष रूप से क्रोमोसोम मियोटिक पेयरिंग का अध्ययन करने और साइटोलॉजिकल फेनोटाइप्स की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकती है, उदाहरण के लिए, सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृत, संकर पुरुष बाँझपन, और शुक्राणुजनन में शामिल जीन के नॉक-आउट।
मलेरिया वैश्विक मानव आबादी के स्वास्थ्य और कल्याण पर एक बड़ा बोझ डालता है। 2021 में, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ने अनुमान लगाया कि मलेरिया के कारण 619,000 मौतें हुईं, जिनमें से 96% उप-सहारा अफ्रीका1 में हुईं। यह रोग एनोफिलीज जीनस से संबंधित मच्छरों द्वारा फैलता है, और उप-सहारा अफ्रीका में, तीन प्रजातियां, अर्थात् एनोफिलीज गैम्बिया (एन गैम्बिया), एनोफिलीज कोलुज़ी (एन, कोलुज़ी) और एनोफिलीज अरेबिएन्सिस (एन. अरेबिएन्सिस) की मलेरिया संचरण में असमान रूप से बड़ी भूमिका है, जो विश्व स्तर पर मलेरिया के 95% मामलों के लिए जिम्मेदार है। कीटनाशकों और एंटीमलेरियल दवाओं जैसे पारंपरिक तरीकों पर निर्भर नियंत्रण कार्यक्रमों ने लाखों लोगों की जान बचाई है; हालांकि, हाल के वर्षों में, इन नियंत्रण विधियों के बढ़ते प्रतिरोध ने उनकी प्रभावकारिता 1,2 को चुनौती दी है। इसके अलावा, कोविड-19 महामारी द्वारा लगाए गए प्रतिबंधों ने प्रमुख मलेरिया नियंत्रण हस्तक्षेपों की उपलब्धता को प्रभावित किया है, जो 2022 डब्ल्यूएचओ विश्व मलेरिया रिपोर्ट के अनुसार, मलेरिया की घटनाओं में वृद्धि हुईहै। पिछले दो दशकों में, एनोफिलीज मच्छरों 3,4,5,6,7,8,9,10 को लक्षित करने के लिए प्रयोगशाला सेटिंग्स में नवीन आनुवंशिक नियंत्रण विधियों को विकसित किया गया है। इन रणनीतियों में, जीन ड्राइव सिस्टम (जीडीएस) और सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृतियों (एसडी) पर आधारित जो आशाजनक लगते हैं। जीडीएस बहुत उच्च आवृत्ति पर, एक आनुवंशिक संशोधन प्रसारित करने की संभावना पर भरोसा करते हैं जो महिला प्रजनन क्षमता को प्रभावित करता है या मच्छर 5,11,12 में परजीवी जीवन चक्र को बाधित करता है। एसडी, इसके बजाय, एक मच्छर वंश के लिंग अनुपात को पुरुषों की ओर मोड़कर कार्य करते हैं, जो समय के साथ, महिलाओं की कमी के कारण लक्षित आबादी के पतन की ओर जाता है। इन आनुवंशिक प्रणालियों के मुख्य घटक मुख्य रूप से मच्छरों के प्रजनन अंगों पर कार्य करते हैं, जहां युग्मक, अंडे और शुक्राणु का उत्पादन मीओटिक डिवीजन14 के बाद होता है।
इस प्रोटोकॉल में, साइटोजेनेटिक तकनीकों में प्रगति को एन गाम्बिया में शुक्राणुजनन का पता लगाने के लिए नियोजित किया जाता है, जो सीटू में गुणसूत्रों के व्यवहार पर ध्यान केंद्रित करता है।मच्छर वृषण की संरचना और इसके भीतर होने वाली जैविक प्रक्रियाओं की जांच पहले कई साइटोलॉजिकल विधियों का उपयोग करके की गई है, जैसे कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ट्रांसजेनेस, और डीएनए और आरएनए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) 15,16,17,18,19,20।; अंग एक स्पिंडल जैसी आकृति दिखाते हैं, जिसमें निचला ध्रुव पुरुष सहायक ग्रंथियों से जुड़े एक डेफरेंट डक्ट से जुड़ा होता है। ऊपरी ध्रुव में, जर्मलाइन स्टेम कोशिकाएं दैहिक कोशिकाओं द्वारा गठित शुक्राणुओं के अंदर एम्बेडेड शुक्राणुकोशिकाओं में प्रसार और अंतर करती हैं। माइटोटिक विभाजन के कई दौर के बाद, शुक्राणुजनन शुक्राणुकोशिकाओं में अंतर करते हैं, जो अर्धसूत्रीविभाजन में प्रवेश करते हैं। प्रोफ़ेज़ में, ऑटोसोम और सेक्स क्रोमोसोम अपने होमोलॉग के साथ जुड़ते हैं, और क्रॉसिंग होती है। मियोटिक विभाजन के बाद, गोल अगुणित शुक्राणु उत्पन्न होते हैं और शुक्राणुजनन में प्रवेश करते हैं, और इस प्रक्रिया से परिपक्व अगुणित शुक्राणुओं का निर्माण होता है जिसमें साइटोप्लाज्म को हटा दिया गया है, परमाणु क्रोमैटिन संघनित हो जाता है, और फ्लैगेला नाभिक21,22 के बेसल भाग में उभरता है (चित्रा 1 और चित्रा 2)।
सामान्य तौर पर, शुक्राणुजनन मध्य-प्यूपल चरण के आसपास शुरू होता है, और शुक्राणु जलाशय23 में देर से प्यूपल चरण में परिपक्व शुक्राणुजनन का पता लगाया जा सकता है। शुक्राणुओं की परिपक्वता प्रक्रिया वयस्क जीवन23,24,25 के दौरान जारी रहती है। एनोफिलीज वृषण में, शुक्राणुजनन के प्रत्येक चरण को प्रत्येक शुक्राणुजनन में कोशिकाओं की परमाणु आकृति विज्ञान को देखकर आसानी से पहचाना जा सकता है (चित्रा 2)। इस प्रोटोकॉल में वर्णित होल-माउंट फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (डब्ल्यूफिश), शोधकर्ताओं को विशेष रूप से एक क्रोमोसोमल क्षेत्र को लेबल करने और अंग और कोशिका नाभिक की स्थिति की मूल संरचना को संरक्षित करते हुए शुक्राणुजनन के दौरान इसे ट्रैक करने की अनुमति देता है; यह मानक डीएनए फिश प्रोटोकॉल की तुलना में एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें अंग को आमतौर पर स्क्वैश किया जाता है, जिससे ऊतक क्षतिहोती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग सेक्स क्रोमोसोम पर दोहराए जाने वाले अनुक्रमों को दागने के लिए किया जाता है और इस प्रकार, शुक्राणुजनन के दौरान उनके व्यवहार को ट्रैक किया जाता है, द्विगुणित विभाजित कोशिकाओं से परिपक्व अगुणित शुक्राणुओं तक। डब्ल्यूफिश विशेष रूप से सेक्स क्रोमोसोम मियोटिक पेयरिंग का अध्ययन करने और साइटोलॉजिकल फेनोटाइप्स की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृत, संकर पुरुष बाँझपन, और शुक्राणुजनन में शामिल जीन के नॉक-आउट 4,19,26,27।
मलेरिया वैक्टर के रूप में उनकी भूमिका को देखते हुए, एनोफिलीज मच्छर आनुवंशिक वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों की बढ़ती संख्या का लक्ष्य हैं, जो अक्सर इन जीवों के प्रजनन अंगों में कार्य करते हैं। कई मच्छर उत्परिवर्ती और साइटोलॉजिकल फेनोटाइप उत्पन्न किए गए हैं जिनके लिए 26,27,28,29 की जांच करने के लिए नवीन साइटोलॉजिकल तकनीकों की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में वर्णित विधि शुक्राणुजनन की समझ पर प्रकाश डालती है, साथ ही आनुवंशिक रणनीतियों के पीछे साइटोलॉजिकल तंत्र जो मलेरिया-संचारित मच्छरों को नियंत्रित करने की क्षमता रखते हैं।
आमतौर पर, फिश प्रोटोकॉल को क्रोमोसोम धुंधला करने की अनुमति देने के लिए रुचि के अंग के स्क्वैश की आवश्यकता होती है। यह उस अंग के भीतर कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था के बारे में जानकारी के नुकसान का कारण बनताहै। यह प्रोटोकॉल बताता है कि कैसे जैविक प्रक्रियाओं, जैसे शुक्राणुजनन, वृषण की बरकरार मूल संरचना और इसके आंतरिक साइटोलॉजिकल संगठन को बनाए रखते हुए सीटू में अध्ययन किया जा सकता है। विभिन्न डीएनए दोहराव वाले तत्वों को लक्षित करने वाली जांच, जो विशेष रूप से सेक्स क्रोमोसोम20 में समृद्ध होती है, का उपयोग शुक्राणु परिपक्वता की गतिशीलता को प्रकट करने के लिए एक साथ किया जा सकता है। वृषण विच्छेदन के समय के आधार पर, डब्ल्यूफिश मच्छर के विकास के माध्यम से शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। डब्ल्यूफिश हाइब्रिड असंगति जैसी विशिष्ट घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, जो एनोफिलीज मच्छरों में, मियोटिक दोषों की उपस्थिति के कारण होता है जैसे कि प्रीमियोटिक विफलता और सेक्स क्रोमोसोम नॉन-डिसजंक्शन 19,34,35। जैविक पहलू के अलावा, शुक्राणुजनन कई आनुवंशिक रणनीतियों का लक्ष्य है जो कीट कीड़ों जैसे एनोफिलीज मच्छरों को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया गया है। इस संदर्भ में, एन गाम्बिया के एक्स-लिंक्ड आरडीएनए लोकस का उपयोग सिंथेटिक लिंग अनुपात विकृत करने वाले को विकसित करने के लिए एक लक्ष्य के रूप में किया गया है, जो एक्स-असर शुक्राणुओं को नुकसान पहुंचाकर, संतान को पुरुषों 4,8,13 के प्रति पूर्वाग्रह करता है।
यह तकनीक प्राकृतिक लिंग अनुपात मिओटिक ड्राइव की कार्रवाई को प्रतिबिंबित करती है जिसे मच्छरों सहित कई टैक्सों में पहचाना गया है, लेकिन यह अभी भी खराब समझा जाता है 28,36,37,38,39,40,41। WFISH इस घटना की जांच करने का अवसर प्रदान करता है और उदाहरण के लिए, सेक्स विरूपण-आधारित आनुवंशिक रणनीतियों को परिष्कृत या सुधारने का मार्ग प्रशस्त करता है, उदाहरण के लिए, सेक्स क्रोमोसोम श्रेडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले लक्ष्य साइटों की पसंद से शुक्राणु उत्पादन की कोशिका विज्ञान कैसे प्रभावित होता है। हालांकि, हमारे अनुभव में, WFISH सफलता की उच्च संभावना दिखाता है, विफलता अभी भी हो सकती है। यह ऊतक परमेबिलाइजेशन के एक अक्षम स्तर के कारण हो सकता है, जिसे मर्मज्ञ समाधान के इनक्यूबेशन समय को बढ़ाकर दूर किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीनेस के का उपयोग परमेबिलाइजेशन चरण के दौरान किया जा सकता है। कुछ मामलों में, हमने जांच प्रवेश का एक गैर-समान स्तर देखा, जिसमें शुक्राणुकोशिकाओं के नाभिक में उच्च संकेत और मियोटिक और शुक्राणुजनन चरणों में कम या अनुपस्थित संकेत थे। यह सेल चरण के आधार पर परमेबिलाइजेशन स्तर में अंतर के कारण हो सकता है। इसके अलावा, उच्च प्रतिलिपि संख्या में मौजूद डीएनए अनुक्रमों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन किए गए फ्लोरोसेंट प्रोब का उपयोग करते समय डब्ल्यूफिश मूल्यवान साबित हुआ। एकल-प्रतिलिपि जीन को लक्षित करते समय, सिग्नल का पता लगाना पर्याप्त नहीं हो सकता है। इस मामले में, सिग्नल प्रवर्धन के तरीके, जैसे टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए), को एकीकृत किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल को इम्यूनोस्टेनिंग या ट्रांसजेनिक रिपोर्टर उपभेदों के साथ जोड़ा जा सकता है जो जर्मलाइन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर16,18 को परेशान करते हैं, क्योंकि यह प्रोटीन स्थानीयकरण और सीटू में जीन अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी जोड़ देगा।इस काम में, डब्ल्यूफिश को एनोफिलीज मच्छरों में शुक्राणुजनन की जांच करने के लिए एक तकनीक के रूप में वर्णित किया गया है; हालांकि, पुरुष प्रजनन अंगों की साझा शारीरिक रचना को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल को अन्य मच्छर प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है जो रोग संचरण में भूमिका निभाते हैं। इसी तरह, इस तकनीक का उपयोग करके महिला गैमेटोजेनेसिस की जांच की जा सकती है। इसके अलावा, अंगों या रुचि के ऊतकों में साइटोलॉजिकल अध्ययन, जैसे कि मच्छर मिडगट, जो परजीवी आक्रमण के लिए एक लक्ष्य है, या एटिपिकल आनुवंशिक पृष्ठभूमि, जैसे कि हाइब्रिड मच्छरों में, का पता लगाया जा सकताहै। इसके अलावा, इस तकनीक को संभावित रूप से डिप्टेरा क्रम के भीतर अन्य जीवों में स्थानांतरित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन और ओपन फिलैनथ्रॉपी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए इंपीरियल कॉलेज लंदन में लाइट माइक्रोस्कोपी (फिल्म) द्वारा इमेजिंग की सुविधा को धन्यवाद देते हैं। चित्र 2 Biorender.com के साथ बनाया गया था।
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy3-dUTP | Cytiva | PA53022 | |
Amersham CyDye Fluorescent Nucleotides, Cy5-dUTP | Cytiva | PA55022 | |
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
CytoBond Removable Coverslip Sealant | SciGene | 2020-00-1 | |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8906-5G | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Embryo Dishes | VWR | 70543-30 | |
Ethanol, molecular grade | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Formamide | ThermoFisher Scientific | 17899 | |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 320331 | |
Microscope slides, SuperFrost | VWR | 631-0114 | |
PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36941 | |
RNase A/T1 Mix | ThermoFisher Scientific | EN0551 | |
Set of dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U1330 | |
Sodium Acetate Solution | ThermoFisher Scientific | R1181 | |
SP8 inverted confocal microscope | Leica | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure Salmon Sperm DNA Solution | ThermoFisher Scientific | 15632011 | |
UltraPure SSC 20x | ThermoFisher Scientific | 15557044 | |
Primer sequences | |||
5’-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGC AAAATCTACGTCTCTAGC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | Contig_240 (X) | |
5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGT CGG TTTCTTCATCCTGAAAGCC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) | |
5’-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGA T GAAGAAACCGACTATTC-3’-[Fluorochrome] |
Eurofins Genomics | AgY477- AgY53B junction region (Y) |
|
F: AACTGTGGAAAAGCCAGAGC R: TCCACTTGATCCTTGCAAAA |
Eurofins Genomics | 18S rDNA (X) | |
F: CCTTTAAACACATGCTCAAATT R: GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG |
Eurofins Genomics | AgY53B (Y) |