Een normotherm ex vivo leverperfusie (NEVLP) systeem werd gecreëerd voor muizenlevers. Dit systeem vereist ervaring in microchirurgie, maar zorgt voor reproduceerbare perfusieresultaten. Het vermogen om muizenlevers te gebruiken vergemakkelijkt het onderzoek van moleculaire routes om nieuwe perfusaatadditieven te identificeren en maakt de uitvoering van experimenten gericht op orgaanherstel mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd erytrocytenvrij NEVLP-systeem met behulp van muizenlevers. Ex vivo conservering van muizenlevers werd bereikt door gebruik te maken van gemodificeerde canules en technieken die waren aangepast aan conventionele commerciële ex vivo perfusieapparatuur. Het systeem werd gebruikt om de conserveringsresultaten na 12 uur perfusie te evalueren. C57BL / 6J-muizen dienden als leverdonoren en de levers werden geëxplanteerd door de poortader (PV) en galwegen (BD) te cannuleren en vervolgens het orgaan te spoelen met warme (37 ° C) gehepariniseerde zoutoplossing. Vervolgens werden de geëxplanteerde levers overgebracht naar de perfusiekamer en onderworpen aan normotherme zuurstofrijke machineperfusie (NEVLP). Inlaat- en uitlaatperfuaatmonsters werden met tussenpozen van 3 uur verzameld voor perfuaatanalyse. Na voltooiing van de perfusie werden levermonsters verkregen voor histologische analyse, waarbij de morfologische integriteit werd beoordeeld met behulp van gemodificeerde Suzuki-Score door hematoxyline-eosine (HE) kleuring. De optimalisatie-experimenten leverden de volgende bevindingen op: (1) muizen met een gewicht van meer dan 30 g werden geschikter geacht voor het experiment vanwege de grotere omvang van hun galwegen (BD). (2) een 2 Fr (buitendiameter = 0,66 mm) polyurethaan canule was beter geschikt voor het cannuleren van de poortader (PV) in vergelijking met een polypropyleen canule. Dit werd toegeschreven aan de verbeterde grip van het polyurethaanmateriaal, wat resulteerde in minder slippen van de katheter tijdens de overdracht van het lichaam naar de orgaankamer. (3) voor cannulatie van de galwegen (BD) bleek een polyurethaancanule van 1 Fr (buitendiameter = 0,33 mm) effectiever te zijn in vergelijking met de polypropyleen UT - 03 (buitendiameter = 0,30 mm) canule. Met dit geoptimaliseerde protocol werden muizenlevers met succes bewaard voor een duur van 12 uur zonder significante impact op de histologische structuur. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring onthulde een goed bewaard gebleven morfologische architectuur van de lever, gekenmerkt door overwegend levensvatbare hepatocyten met duidelijk zichtbare kernen en milde verwijding van hepatische sinusoïden.
Inleiding
Levertransplantatie vertegenwoordigt de gouden standaardbehandeling voor personen met een leverziekte in het eindstadium. Helaas overtreft de vraag naar donororganen het beschikbare aanbod, wat leidt tot een aanzienlijk tekort. In 2021 stonden ongeveer 24.936 patiënten op de wachtlijst voor een levertransplantatie, terwijl slechts 9.234 transplantaties succesvol werden uitgevoerd1. Het aanzienlijke verschil tussen vraag en aanbod van levertransplantaten benadrukt de dringende noodzaak om alternatieve strategieën te onderzoeken om de donorpool te verbreden en de toegankelijkheid van levertransplantaten te verbeteren. Een manier om de donorpool u....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd volgens de huidige Duitse regelgeving en richtlijnen voor dierenwelzijn en de ARRIVE-richtlijnen voor het rapporteren van dierproeven. Het protocol voor dierproeven is goedgekeurd door het Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Duitsland (goedkeuringsnummer: UKJ - 17 - 106).
OPMERKING: Mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 34 ± 4 g (gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde [SEM]) werden gebruikt als leverdonor. Ze werden onderhouden onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (50% vochtigheid en 18 - 23 °C) met vrije toegang tot standaard muischow en water. Gedurende de gehele chiru....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vaststelling van de chirurgische procedure
In totaal werden 17 dieren gebruikt voor dit experiment: 14 muizen werden gebruikt voor het optimaliseren van het orgaanverkrijgingsproces, inclusief cannulatie van de poortader (PV) en galwegen (BD), terwijl 3 muizen werden gebruikt om de procedure te valideren (tabel 1). Histologische resultaten (figuur 3) werden vergeleken om de identificatie van de optimale perfusieconditie te vergemakkelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritieke stappen in het protocol
De twee cruciale stappen bij leverexplantatie zijn de cannulatie van de poortader (PV) en de daaropvolgende cannulatie van het galkanaal (BD). Deze stappen zijn van het grootste belang voor het succesvol ophalen van organen en de daaropvolgende perfusie- of transplantatieprocedures.
Uitdagingen en oplossingen
PV-cannulatie brengt drie uitdagingen met zich mee: letsel van de vaatwand, verplaatsing van de katheter en uitvoe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen financiële belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Tijdens het schrijven van dit artikel heb ik veel steun en hulp gekregen. Ik wil in het bijzonder mijn teamgenoot XinPei Chen bedanken voor zijn geweldige samenwerking en geduldige ondersteuning tijdens mijn operatie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
Referenties
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
