Mesure de la consommation d’O2 chez Drosophila melanogaster à l’aide de la microrespirométrie coulométrique

Summary

La respirométrie coulométrique est idéale pour mesurer le taux métabolique des petits organismes. Lorsqu’elle a été adaptée pour Drosophila melanogaster dans la présente étude, la consommation d’O₂ mesurée se situait dans la fourchette rapportée pour le type sauvage D. melanogaster par des études antérieures. La consommation d’O₂ par mouche par les mutants CAS, qui sont plus petits et moins actifs, était significativement inférieure à celle du type sauvage.

Abstract

La microrespirométrie coulométrique est une méthode simple et peu coûteuse pour mesurer la consommation d’O₂ de petits organismes tout en maintenant un environnement stable. Un microrespiromètre coulométrique est constitué d’une chambre hermétique dans laquelle l’O 2 est consommé et le CO₂ produit par l’organisme est éliminé par un milieu absorbant. La diminution de pression qui en résulte déclenche la production électrolytique d’O2, et la quantité d’O2 produite est mesurée en enregistrant la quantité de charge utilisée pour la générer. Dans la présente étude, la méthode a été adaptée à Drosophila melanogaster testée en petits groupes, avec la sensibilité de l’appareil et les conditions environnementales optimisées pour une grande stabilité. La quantité_d’O2 consommée par les mouches sauvages dans cet appareil est cohérente avec celle mesurée par des études antérieures. La consommation d’O₂ spécifique à la masse par les mutants CASK qui sont plus petits et connus pour être moins actifs, n’était pas différente de celle des témoins congéniques. Cependant, la petite taille des mutants CASK a entraîné une réduction significative de la consommation d’O₂ par mouche. Par conséquent, le microrespiromètre est capable de mesurer la consommation d’O₂ chez D. melanogaster, de distinguer des différences modestes entre les génotypes et d’ajouter un outil polyvalent pour mesurer les taux métaboliques.

Introduction

La capacité de mesurer le taux métabolique est cruciale pour une compréhension complète d’un organisme dans son contexte environnemental. Par exemple, il est nécessaire de mesurer le taux métabolique afin de comprendre son rôle dans la durée de vie¹, le rôle de l’alimentation dans le métabolisme², ou encore le seuil du stress hypoxique³.

Il existe deux approches générales pour mesurer le taux métabolique⁴. La calorimétrie directe mesure directement la dépense énergétique en mesurant la production de chaleur. La calorimétrie indirecte mesure la production d’énergie par d’autres moyens, souvent par mesure respirométrique de la consommation d’O2 (V,_O2), de_CO2 ou des deux. Bien que la calorimétrie directe ait été appliquée à de petits ectothermes, y compris Drosophila melanogaster⁵, la respirométrie est techniquement plus simple et plus couramment utilisée.

Plusieurs formes de respirométrie ont été utilisées avec succès pour mesurer le taux métabolique chez D. melanogaster de type sauvage et mutant et ont fourni un aperçu des effets métaboliques de la température⁶, de l’environnement social 3, de l’alimentation ^{3,7 et des} troubles neurodéveloppementaux⁸. Ceux-ci se répartissent en deux classes, dont le coût et la complexité varient considérablement. La manométrie est la plus simple et la moins coûteuse^9,10, dans laquelle les mouches sont placées dans une chambre scellée qui contient un absorbant de CO₂ et qui est reliée par un mince capillaire à un réservoir de fluide. Au fur et à mesure que l’O 2 est consommé et que le CO₂ est absorbé, la pression dans la chambre diminue et le fluide est aspiré dans le capillaire. Le volume rempli de liquide du capillaire est donc proportionnel à V_O2. Des versions plus élaborées, qui compensent la force exercée par le fluide dans le capillaire, ont également été utilisées sur D. melanogaster¹. La manométrie a l’avantage d’être simple et peu coûteuse, mais, parce qu’elle est sensible à la pression, elle nécessite des conditions environnementales constantes. De plus, comme l’O 2 consommé n’est pas remplacé, la pression partielle d’O₂ (P_O2) diminue progressivement à l’intérieur des chambres.

La respirométrie utilisant l’analyse des gaz est également régulièrement utilisée pour D. melanogaster. Dans ce cas, les gaz sont échantillonnés à intervalles réguliers dans des chambres scellées contenant des mouches et envoyés à un analyseur infrarouge ^2,6,11. Ce type d’appareil présente l’avantage d’être disponible dans le commerce, d’être moins sensible aux conditions environnementales et de rafraîchir les gaz pendant l’échantillonnage afin que le P_O2 reste stable. Cependant, l’équipement peut être coûteux et complexe à utiliser.

Un microrespiromètre coulométrique récemment mis au point¹² offre une alternative peu coûteuse, sensible et stable aux systèmes existants. En pratique, un organisme est placé dans une chambre hermétique où il consomme de l’O 2 et le CO₂ expiré est éliminé par un matériau absorbant, ce qui entraîne une diminution nette de la pression de la chambre. Lorsque la pression interne diminue jusqu’à un seuil prédéfini (seuil ON), le courant passe à travers un générateur électrolytique d’O2, ramenant la pression à un deuxième seuil (seuil OFF) arrêtant l’électrolyse. Le transfert de charge à travers le générateur d’O2 est directement proportionnel à la quantité d’O2 nécessaire pour repressuriser la chambre et peut donc être utilisé pour mesurer l’O2 consommé par l’organisme⁴. La méthode est très sensible, mesure la V O2 avec précision, et le remplacement régulier de l’O₂ peut maintenir la P_O2 à un niveau presque constant pendant des heures ou des jours.

Le microrespiromètre coulométrique utilisé dans cette étude utilise un capteur électronique multimodal (pression, température et humidité). Le capteur est actionné par un microcontrôleur qui détecte les petits changements de pression et active la génération d’O₂ lorsqu’un seuil de basse pression est atteint¹². Cet appareil est assemblé à partir de pièces prêtes à l’emploi, peut être utilisé avec une grande variété de chambres et d’environnements expérimentaux, et a été utilisé avec succès pour examiner les effets de la masse corporelle et de la température sur le coléoptère Tenebrio molitor. Dans la présente étude, le microrespiromètre a été adapté pour mesurer la consommation d’O₂ chez D. melanogaster, qui représente environ 1 % de la masse de T. molitor. La sensibilité de l’appareil a été augmentée en abaissant le seuil d’activation de la génération d’O2, et la stabilité de l’environnement a été améliorée en effectuant des expériences dans un bain-marie à température contrôlée et en maintenant l’humidité à l’intérieur des chambres à 100 % ou presque.

La protéine CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), qui fait partie de la famille des guanylate kinases associées à la membrane (MAGUK), est un échafaudage moléculaire dans différents complexes multiprotéiques, et les mutations de CASK sont associées à des troubles neurodéveloppementaux chez l’homme et chez D. melanogaster^13,14. Un mutant viable de D. melanogaster, CASK^Δ18, perturbe l’activité des neurones dopaminergiques 15 et réduit les niveaux d’activité de plus de 50 % par rapport aux témoins congéniques^14,16. En raison des niveaux d’activité réduits des mutants CASK et du rôle des catécholamines dans la régulation du métabolisme^{, nous avons} émis l’hypothèse que leur taux métabolique standard, et donc leur consommation d’O₂, seraient considérablement réduits par rapport aux témoins.

La consommation_d’O2 a été mesurée dans le fût^Δ18 et leurs congénères de type sauvage, w(ex33). Des groupes de mouches ont été placés dans des chambres de respirométrie, la consommation d’O2 a été mesurée, la consommation d’O2 a été calculée et exprimée à la fois en fonction de la masse et par mouche. L’appareil a enregistré la V O2 chez les mouches de type sauvage, ce qui était cohérent avec les études précédentes, et il a pu faire la différence entre la consommation_d’O2 par mouche des mouches mutantes de type sauvage et CASK mutantes.

Protocol

1. Élevage et collecte de mouches Maintenir les mouches à 25 °C dans des flacons étroits contenant de la nourriture standard pour drosophiles .NOTA : La taille de l’échantillon pour chaque génotype doit comprendre au moins neuf répétitions, chacune consistant en une seule chambre respirométrique contenant 15 à 25 mouches, configurée comme décrit ci-dessous. Transférez les mouches tous les 2-3 jours. Anesthésier les mouches avec du CO2,…

Representative Results

Les sorties de pression et de courant du contrôleur du respiromètre sont illustrées pour une chambre dans une expérience à la figure 3A. La première impulsion de courant long a pressurisé la chambre de la pression ambiante (environ 992 hPa) au seuil d’arrêt prédéfini de 1017 hPa. Au fur et à mesure que les mouches consommaient de l’O 2 et que le CO2 était absorbé, la pression diminuait lentement jusqu’à ce qu’elle atteigne le seuil ON de 1016 hPa, …

Discussion

La procédure ci-dessus illustre la mesure de la consommation d’O₂ chez D. Melanogaster à l’aide d’un microrespiromètre coulométrique électronique. Les données obtenues pour la consommation_d’O2 chez le D. melanogaster de type sauvage se situaient dans les fourchettes décrites dans la plupart des publications antérieures utilisant diverses méthodes (tableau 1), bien qu’un peu inférieures à celles rapportées^{par d’autres} …

Materials

19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers