Messung desO2-Verbrauchs in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

Summary

Die coulometrische Respirometrie ist ideal für die Messung der Stoffwechselrate kleiner Organismen. Bei der Adaption für Drosophila melanogaster in der vorliegenden Studie lag der gemessene_O2-Verbrauch innerhalb des Bereichs, der in früheren Studien für Wildtyp D. melanogaster berichtet wurde. Der_O2-Verbrauch pro Fliege war bei CASK-Mutanten , die kleiner und weniger aktiv sind, signifikant niedriger als beim Wildtyp.

Abstract

Die coulometrische Mikrorespirometrie ist eine einfache, kostengünstige Methode zur Messung des_{O2-Verbrauchs} kleiner Organismen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung eines stabilen Milieus. Ein coulometrisches Mikrorespirometer besteht aus einer luftdichten Kammer, in der O2 verbraucht und das vom Organismus produzierte_CO2 durch ein absorbierendes Medium entfernt wird. Der resultierende Druckabfall löst die elektrolytische_{O2-Produktion} aus, und die Menge an erzeugtem_O2 wird gemessen, indem die Menge der Ladung aufgezeichnet wird, die zu ihrer Erzeugung verwendet wurde. In der vorliegenden Studie wurde die Methode an Drosophila melanogaster angepasst, die in kleinen Gruppen getestet wurde, wobei die Empfindlichkeit der Apparatur und die Umgebungsbedingungen für eine hohe Stabilität optimiert wurden. Die Menge an_O2, die von Wildtyp-Fliegen in diesem Apparat verbraucht wird, stimmt mit der in früheren Studien gemessenen Menge überein. Der massenspezifische_O2-Verbrauch von CASK-Mutanten, die kleiner sind und von denen bekannt ist, dass sie weniger aktiv sind, unterschied sich nicht von kongenen Kontrollen. Die geringe Größe der CASK-Mutanten führte jedoch zu einer signifikanten Reduzierung des_{O2-Verbrauchs} pro Fliege. Daher ist das Mikrorespirometer in der Lage, den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, kann bescheidene Unterschiede zwischen Genotypen unterscheiden und ist ein vielseitiges Werkzeug zur Messung der Stoffwechselraten.

Introduction

Die Fähigkeit, die Stoffwechselrate zu messen, ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis eines Organismus in seinem Umweltkontext. Zum Beispiel ist es notwendig, die Stoffwechselrate zu messen, um ihre Rolle in der Lebensspanne¹, die Rolle der Ernährung im Stoffwechsel² oder die Schwelle für hypoxischen Stress³ zu verstehen.

Es gibt zwei allgemeine Ansätze zur Messung der Stoffwechselrate⁴. Die direkte Kalorimetrie misst den Energieverbrauch direkt durch die Messung der Wärmeproduktion. Die indirekte Kalorimetrie misst die Energieerzeugung auf andere Weise, oft durch respirometrische Messung des O2-Verbrauchs (V_O2), der CO_{2 –}Produktion oder beidem. Obwohl die direkte Kalorimetrie bei kleinen Ektothermen, einschließlich Drosophila melanogaster⁵, angewendet wurde, ist die Respirometrie technisch einfacher und wird häufiger verwendet.

Verschiedene Formen der Respirometrie wurden erfolgreich zur Messung der Stoffwechselrate bei Wildtyp- und mutierten D. melanogaster eingesetzt und haben Einblicke in die metabolischen Auswirkungen von Temperatur⁶, sozialem Umfeld 3, Ernährung^{3, 7 und} neurologischen Entwicklungsstörungen⁸ gegeben. Diese lassen sich in zwei Klassen einteilen, die sich in Kosten und Komplexität erheblich unterscheiden. Die Manometrie ist die einfachste und kostengünstigste ^9,10, bei der die Fliegen in eine geschlossene Kammer gesetzt werden, die ein_{CO2-Absorptionsmittel} enthält und über eine dünne Kapillare mit einem Flüssigkeitsreservoir verbunden ist. Wenn_O2 verbraucht und_CO2 absorbiert wird, sinkt der Druck in der Kammer und Flüssigkeit wird in die Kapillare gesaugt. Das flüssigkeitsgefüllte Volumen der Kapillare ist also proportional zu V_O2. Aufwendigere Versionen, die die Kraft der Flüssigkeit in der Kapillare kompensieren, wurden auch bei D. melanogaster¹ eingesetzt. Die Manometrie hat den Vorteil, dass sie einfach und kostengünstig ist, aber da sie druckempfindlich ist, erfordert sie konstante Umgebungsbedingungen. Da das verbrauchte O2 nicht ersetzt wird, nimmt der Partialdruck von O2 (_PO2) in den Kammern allmählich ab.

Auch die Respirometrie mittels Gasanalyse wird regelmäßig bei D. melanogaster eingesetzt. In diesem Fall werden Gase in regelmäßigen Abständen aus versiegelten Kammern, die Fliegen enthalten, entnommen und an einen Infrarot-Analysator ^2,6,11 geschickt. Diese Art von Apparatur hat den Vorteil, dass sie im Handel erhältlich ist, weniger empfindlich auf Umweltbedingungen reagiert und Gase während der Probenahme aufgefrischt werden, so dass P_O2 stabil bleibt. Die Geräte können jedoch teuer und komplex im Betrieb sein.

Ein kürzlich entwickeltes coulometrisches Mikrorespirometer¹² bietet eine kostengünstige, empfindliche und stabile Alternative zu bestehenden Systemen. In der Praxis wird ein Organismus in eine luftdichte Kammer gebracht, wo er O2 verbraucht und das ausgeatmete_CO2 durch ein absorbierendes Material entfernt wird, was zu einer Nettoabnahme des Kammerdrucks führt. Wenn der Innendruck auf einen voreingestellten Schwellenwert (ON-Schwelle) sinkt, wird Strom durch einen elektrolytischen_O2-Generator geleitet, der den Druck auf einen zweiten Schwellenwert (OFF-Schwelle) zurückführt und die Elektrolyse stoppt. Die Ladungsübertragung über den O2-Generator ist direkt proportional zu der Menge an O2, die erforderlich ist, um die Kammer wieder unter Druck zu setzen, und kann daher verwendet werden, um das vom Organismus⁴ verbrauchte_O2 zu messen. Die Methode ist hochempfindlich, misst V O2 präzise, und der regelmäßige Austausch von O2 kann P_O2 über Stunden oder Tage auf einem nahezu konstanten Niveau halten.

Das coulometrische Mikrorespirometer, das in dieser Studie verwendet wird, verwendet einen multimodalen (Druck, Temperatur und Feuchtigkeit) elektronischen Sensor. Der Sensor wird von einem Mikrocontroller betrieben, der kleine Druckänderungen erkennt und bei Erreichen einer niedrigen Druckschwelle^{12 die O2-Generation} aktiviert. Diese Apparatur wird aus handelsüblichen Teilen zusammengebaut, kann mit einer Vielzahl von Kammern und Versuchsumgebungen verwendet werden und wurde erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von Körpermasse und Temperatur auf den Käfer Tenebrio molitor zu untersuchen. In der vorliegenden Studie wurde das Mikrorespirometer angepasst, um den_O2-Verbrauch in D. melanogaster zu messen, der etwa 1% der Masse von T. molitor aufweist. Die Empfindlichkeit der Apparatur wurde erhöht, indem die Schwelle für die Aktivierung der_O2-Erzeugung gesenkt wurde, und die Umgebungsstabilität wurde durch die Durchführung von Experimenten in einem temperaturgesteuerten Wasserbad und durch die Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit in den Kammern bei oder nahe 100 % erhöht.

Das CASK-Protein (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), das zur Familie der membranassoziierten Guanylatkinasen (MAGUK) gehört, ist ein molekulares Gerüst in verschiedenen Multiproteinkomplexen, und Mutationen in CASK sind mit neurologischen Entwicklungsstörungen beim Menschen und bei D. melanogaster assoziiert ^13,14. Eine lebensfähige D. melanogaster-Mutante, CASK^Δ18, stört die Aktivität dopaminerger Neuronen 15 und reduziert das Aktivitätsniveau um mehr als 50 % im Vergleich zu kongenen Kontrollen^14,16. Aufgrund der reduzierten Aktivität von CASK-Mutanten und der Rolle von Katecholaminen bei der Regulierung des Stoffwechsels¹⁷ stellten wir die Hypothese auf, dass ihre Standardstoffwechselrate und damit der_O2-Verbrauch im Vergleich zu Kontrollen dramatisch reduziert wäre.

Der O2-Verbrauch wurde in CASK^Δ18 und ihren_{Wildtyp-Artgenossen} w(ex33) gemessen. Gruppen von Fliegen wurden in Respirometriekammern gesetzt, der O2-Verbrauch wurde gemessen, der_O2-Verbrauch wurde berechnet und sowohl massenspezifisch als auch pro Fliege ausgedrückt. Die Apparatur zeichnete V O2 in Wildtyp-Fliegen auf, was mit früheren Studien übereinstimmte, und sie konnte zwischen dem_O2-Verbrauch pro Fliege von Wildtyp- und CASK-mutierten Fliegen unterscheiden.

Protocol

1. Fliegenaufzucht und -sammlung Halten Sie Fliegen bei 25 °C in schmalen Fläschchen mit Standardfutter für Drosophila .HINWEIS: Die Probengröße für jeden Genotyp sollte mindestens neun Wiederholungen umfassen, die jeweils aus einer einzigen Respirometerkammer mit 15-25 Fliegen bestehen, die wie unten beschrieben eingerichtet sind. Transferieren Sie die Fliegen alle 2-3 Tage. Betäuben Sie Fliegen mit CO2, sammeln Sie Gruppen von 15-25 Männchen…

Representative Results

Die Druck- und Stromausgänge des Respirometer-Controllers sind für eine Kammer in einem Experiment in Abbildung 3A dargestellt. Der erste, lange Stromimpuls beaufschlagte die Kammer vom Umgebungsdruck (ca. 992 hPa) bis zur voreingestellten Ausschaltschwelle von 1017 hPa. Als die Fliegen O 2 verbrauchten und CO2 absorbiert wurde, sank der Druck langsam, bis er die EIN-Schwelle von 1016 hPa erreichte, wodurch Strom durch denO2-Generator aktiviert wurde. Im ge…

Discussion

Das obige Verfahren zeigt die Messung des_{O2-Verbrauchs} in D. Melanogaster mit einem elektronischen coulometrischen Mikrorespirometer. Die resultierenden Daten für den_O2-Verbrauch bei Wildtyp-D. melanogaster lagen innerhalb der Bereiche, die in den meisten früheren Veröffentlichungen mit verschiedenen Methoden beschrieben wurden (Tabelle 1), wenn auch etwas niedriger als die^{von anderen berichteten 3,6}.</p…

Materials

19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers