מדידת צריכת O2 בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית
Summary
ספירומטריה קולומטרית אידיאלית למדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים קטנים. כאשר הותאם עבור Drosophila melanogaster במחקר הנוכחי, צריכת O2 שנמדדה הייתה בטווח שדווח עבור סוג בר D. melanogaster על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 לכל זבוב על ידי מוטנטים של ASK שהם קטנים יותר ופעילים פחות, הייתה נמוכה משמעותית מזו של ה-wildtype .
Abstract
מיקרו-רספירומטריה קולומטרית היא שיטה פשוטה וזולה למדידת צריכת O2 של אורגניזמים קטנים תוך שמירה על סביבה יציבה. מיקרו-רספירומטר קולומטרי מורכב מתא אטום שבו O 2 נצרך וה- CO2 המיוצר על ידי האורגניזם מוסר על ידי מדיום סופג. ירידת הלחץ כתוצאה מכך מפעילה ייצור אלקטרוליטי O 2, וכמות O2 המיוצרת נמדדת על ידי רישום כמות המטען המשמש ליצירתו. במחקר הנוכחי הותאמה השיטה לדרוזופילה מלנוגסטר שנבדקה בקבוצות קטנות, כאשר רגישות המכשיר ותנאי הסביבה מותאמים ליציבות גבוהה. כמות O2 הנצרכת על ידי זבובי בר במנגנון זה עקבית עם זו שנמדדה על ידי מחקרים קודמים. צריכת O2 ספציפית למסה על ידי מוטנטים של TASK, שהם קטנים יותר וידועים כפחות פעילים, לא הייתה שונה מקבוצת ביקורת קונגנית. עם זאת, הגודל הקטן של מוטנטים CASK הביא לירידה משמעותית בצריכת O2 על בסיס זבוב. לכן, המיקרו-רספירומטר מסוגל למדוד את צריכת O2 ב-D. melanogaster, יכול להבחין בהבדלים צנועים בין גנוטיפים, ומוסיף כלי רב-תכליתי למדידת קצב חילוף החומרים.
Introduction
היכולת למדוד קצב חילוף חומרים חיונית להבנה מלאה של אורגניזם בהקשר הסביבתי שלו. לדוגמה, יש צורך למדוד את קצב חילוף החומרים כדי להבין את תפקידו בתוחלת החיים1, את תפקיד הדיאטה בחילוף החומרים2, או את הסף ללחץ היפוקסי3.
ישנן שתי גישות כלליות למדידת קצב חילוף החומרים4. קלורימטריה ישירה מודדת את הוצאת האנרגיה ישירות על ידי מדידת ייצור חום. קלורימטריה עקיפה מודדת את ייצור האנרגיה באמצעים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מדידה ספירומטרית של צריכת O 2 (VO2), ייצור CO2 או שניהם. למרות שקלורימטריה ישירה יושמה על אקטורמות קטנות, כולל Drosophila melanogaster5, רספירומטריה היא פשוטה יותר מבחינה טכנית ונפוצה יותר.
מספר צורות של רספירומטריה שימשו בהצלחה למדידת קצב חילוף החומרים בטבע ובמוטציה D. melanogaster וסיפקו תובנה לגבי ההשפעות המטבוליות של טמפרטורה6, סביבה חברתית 3, תזונה 3,7 והפרעות נוירו-התפתחותיות8. אלה נופלים לשני סוגים, אשר משתנים במידה ניכרת בעלות ובמורכבות. מנומטריה היאה-9,10 הפשוטה והזולה ביותר, שבה הזבובים מוכנסים לתא אטום המכיל סופגCO2 ומחובר באמצעות נימים דקים למאגר נוזלים. כאשר O 2 נצרך ו- CO2 נספג, הלחץ בחדר יורד ונוזל נשאב לתוך הנימים. הנפח המלא בנוזל של הנימים הוא אפוא פרופורציונלי ל- VO2. גרסאות משוכללות יותר, המפצות על הכוח המופעל על ידי הנוזל בנימים, שימשו גם על D. melanogaster1. למנומטריה יש את היתרונות של היותה פשוטה וזולה, אך מכיוון שהיא רגישה ללחץ, דורשת תנאי סביבה קבועים. יתר על כן, מכיוון שנצרך O 2 אינו מוחלף, הלחץ החלקי של O2 (PO2) יורד בהדרגה בתוך החדרים.
רספירומטריה באמצעות ניתוח גז משמשת באופן קבוע גם עבור D. melanogaster. במקרה זה, גזים נדגמים במרווחי זמן קבועים מחדרים אטומים המכילים זבובים ונשלחים לאנלייזר אינפרא אדום 2,6,11. לסוג זה של מכשיר יש את היתרונות שהוא זמין מסחרית, הוא פחות רגיש לתנאי הסביבה, וגזים מתחדשים במהלך הדגימה כך ש- PO2 נשאר יציב. עם זאת, הציוד יכול להיות יקר ומורכב לתפעול.
מיקרו-רספירומטרקולומטרי 12 שפותח לאחרונה מספק חלופה זולה, רגישה ויציבה למערכות קיימות. בפועל, אורגניזם ממוקם לתוך תא אטום שבו הוא צורך O 2 ואת CO2 נשוף מוסר על ידי חומר סופג, וכתוצאה מכך ירידה נטו בלחץ החדר. כאשר הלחץ הפנימי יורד לסף מוגדר מראש (ON-threshold), הזרם מועבר דרך מחולל אלקטרוליטי O2, ומחזיר את הלחץ לסף שני (OFF-threshold) העוצר אלקטרוליזה. העברת מטען על פני מחולל O 2 עומדת ביחס ישר לכמות O 2 הנדרשת ללחץ מחדש על התא ולכן ניתן להשתמש בה כדי למדוד את O2 הנצרך על ידי האורגניזם4. השיטה רגישה מאוד, מודדת V O2 במדויק, וההחלפה הקבועה של O2 יכולה לשמור על PO2 ברמה כמעט קבועה במשך שעות או ימים.
המיקרו-רספירומטר הקולומטרי המשמש במחקר זה משתמש בחיישן אלקטרוני רב-מודאלי (לחץ, טמפרטורה ולחות). החיישן מופעל על ידי מיקרו-בקר המזהה שינויים קטנים בלחץ ומפעיל דורO 2 כאשר מגיעים לסף לחץ נמוך12. מכשיר זה מורכב מחלקי המדף, ניתן להשתמש בו עם מגוון רחב של תאים וסביבות ניסוי, ושימש בהצלחה לבחינת ההשפעות של מסת הגוף והטמפרטורה על החיפושית Tenebrio molitor. במחקר הנוכחי, המיקרו-רספירומטר הותאם למדידת צריכת O2 ב- D. melanogaster, שיש לו כ -1% מהמסה של T. molitor. רגישות המנגנון הוגברה על ידי הפחתת הסף להפעלת דורO 2 , והיציבות הסביבתית שופרה על ידי ביצוע ניסויים באמבט מים מבוקר טמפרטורה ועל ידי שמירה על לחות בתוך התאים ברמה של 100% או קרוב לכך.
חלבון CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), חלק ממשפחת הקינאזות הגואנילטות הקשורות לקרום (MAGUK), הוא פיגום מולקולרי בקומפלקסים רב-חלבוניים שונים, ומוטציות ב-CASK קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות בבני אדם וב-D. melanogaster13,14. מוטציה בת קיימא של D. melanogaster, CASKΔ18, משבשת את הפעילות של נוירונים דופמינרגיים 15 ומפחיתה את רמות הפעילות ביותר מ-50% בהשוואה לבקרות קונגניות14,16. בגלל רמות הפעילות הנמוכות יותר של מוטציות CASK ותפקידם של קטכולאמינים בוויסות חילוף החומרים17 שיערנו שקצב חילוף החומרים הסטנדרטי שלהם, ולכן צריכת O2, יופחתו באופן דרמטי בהשוואה לבקרות.
צריכת O2 נמדדה ב-CASKΔ18 ובקונגנרים הפראיים שלהם, w(ex33). קבוצות של זבובים הוכנסו לתאי רספירומטריה, צריכת O 2 נמדדה, צריכת O2 חושבה והתבטאה הן על בסיס מסה ספציפית והן על בסיס זבוב. המנגנון תיעד VO2 בזבובי בר שהיה עקבי עם מחקרים קודמים, והוא יכול היה להבדיל בין צריכת O2 לכל זבוב של זבובי בר לבין צריכת מוטציות CASK לכל זבוב.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך לעיל מדגים מדידה של צריכת O2 ב- D. Melanogaster באמצעות מיקרו-רספירומטר קולומטרי אלקטרוני. הנתונים שהתקבלו עבור צריכת O2 במלנוגסטר מסוג D פראי היו בטווח שתואר ברוב הפרסומים הקודמים בשיטות מגוונות (טבלה 1), אם כי נמוכים במקצת מאלה שדווחו על ידי אחרים 3,6<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר לינדה רסטיפו מאוניברסיטת אריזונה על שהציעה לבדוק את צריכת O2 של מוטציות CASK ועל שליחת מוטנטי CASK והבקרות הקונגניות שלהם. דמי הפרסום ניתנו על ידי הקרן המחלקתית להשקעה מחדש מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קולג’ פארק. שטח וכמה ציוד סופקו על ידי האוניברסיטאות בשיידי גרוב.
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. . Measuring Metabolic Rates. , (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Genetics. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J. Permeation of gases through solids. Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
