Misurazione del consumo di O2 in Drosophila melanogaster mediante microrespirometria coulometrica
Summary
La respirometria coulometrica è ideale per misurare il tasso metabolico di piccoli organismi. Quando è stato adattato per Drosophila melanogaster nel presente studio, il consumo di O2 misurato era all’interno dell’intervallo riportato per D. melanogaster selvatico da studi precedenti. Il consumo di O2 per mosca da parte dei mutanti CASK , che sono più piccoli e meno attivi, è stato significativamente inferiore rispetto al wildtype.
Abstract
La microrespirometria coulometrica è un metodo semplice ed economico per misurare il consumo di O2 di piccoli organismi mantenendo un ambiente stabile. Un microrespirometro coulometrico è costituito da una camera ermetica in cui l’O 2 viene consumato e la CO2 prodotta dall’organismo viene rimossa da un mezzo assorbente. La diminuzione di pressione risultante innesca la produzione elettrolitica di O 2 e la quantità di O2 prodotta viene misurata registrando la quantità di carica utilizzata per generarlo. Nel presente studio, il metodo è stato adattato a Drosophila melanogaster testato in piccoli gruppi, con la sensibilità dell’apparato e le condizioni ambientali ottimizzate per un’elevata stabilità. La quantità di O2 consumata dalle mosche selvatiche in questo apparato è coerente con quella misurata da studi precedenti. Il consumo di O2 specifico per la massa da parte dei mutanti CASK, che sono più piccoli e noti per essere meno attivi, non era diverso dai controlli congeniti. Tuttavia, le piccole dimensioni dei mutanti CASK hanno portato a una significativa riduzione del consumo di O2 su base per mosca. Pertanto, il microrespirometro è in grado di misurare il consumo di O2 in D. melanogaster, è in grado di distinguere modeste differenze tra i genotipi e aggiunge uno strumento versatile per misurare i tassi metabolici.
Introduction
La capacità di misurare il tasso metabolico è fondamentale per una comprensione completa di un organismo nel suo contesto ambientale. Ad esempio, è necessario misurare il tasso metabolico per comprendere il suo ruolo nella durata della vita1, il ruolo della dieta nel metabolismo2 o la soglia per lo stress ipossico3.
Esistono due approcci generali per misurare il tasso metabolico4. La calorimetria diretta misura il dispendio energetico direttamente misurando la produzione di calore. La calorimetria indiretta misura la produzione di energia con altri mezzi, spesso attraverso la misurazione respirometrica del consumo di O 2 (V O2), della produzione di CO2 o di entrambi. Sebbene la calorimetria diretta sia stata applicata a piccoli ectotermi, tra cui Drosophila melanogaster5, la respirometria è tecnicamente più semplice e più comunemente usata.
Diverse forme di respirometria sono state utilizzate con successo per misurare il tasso metabolico in D. melanogaster wildtype e mutante e hanno fornito informazioni sugli effetti metabolici della temperatura6, dell’ambiente sociale 3, della dieta 3,7 e dei disturbi dello sviluppo neurologico8. Questi si dividono in due classi, che variano considerevolmente in termini di costi e complessità. La manometria è la più semplice e meno costosa 9,10, in cui le mosche vengono poste in una camera sigillata che contiene un assorbente di CO 2 e che è collegata tramite un sottile capillare a un serbatoio di fluido. Man mano che l’O 2 viene consumato e la CO2 assorbita, la pressione nella camera diminuisce e il fluido viene aspirato nel capillare. Il volume riempito di liquido del capillare è quindi proporzionale a VO2. Versioni più elaborate, che compensano la forza esercitata dal fluido nel capillare, sono state utilizzate anche su D. melanogaster1. La manometria ha il vantaggio di essere semplice ed economica, ma, poiché è sensibile alla pressione, richiede condizioni ambientali costanti. Inoltre, poiché l’O 2 consumato non viene sostituito, la pressione parziale di O2 (PO2) diminuisce gradualmente all’interno delle camere.
La respirometria con l’analisi dei gas viene regolarmente utilizzata anche per D. melanogaster. In questo caso, i gas vengono campionati a intervalli regolari da camere sigillate contenenti mosche e inviati a un analizzatore a infrarossi 2,6,11. Questo tipo di apparecchio ha il vantaggio di essere disponibile in commercio, è meno sensibile alle condizioni ambientali e i gas vengono rinfrescati durante il campionamento in modo che il PO2 rimanga stabile. Tuttavia, l’apparecchiatura può essere costosa e complessa da utilizzare.
Un microrespirometro coulometrico12 di recente sviluppo fornisce un’alternativa economica, sensibile e stabile ai sistemi esistenti. In pratica, un organismo viene posto in una camera ermetica dove consuma O 2 e la CO2 espirata viene rimossa da un materiale assorbente, con conseguente diminuzione netta della pressione della camera. Quando la pressione interna scende ad una soglia preimpostata (soglia ON), la corrente viene fatta passare attraverso un generatore elettrolitico di O2 , riportando la pressione ad una seconda soglia (soglia OFF) arrestando l’elettrolisi. Il trasferimento di carica attraverso il generatore di O 2 è direttamente proporzionale alla quantità di O 2 necessaria per ripressurizzare la camera e può quindi essere utilizzato per misurare l’O2 consumato dall’organismo4. Il metodo è altamente sensibile, misura con precisione V O2 e la sostituzione regolare di O2 può mantenere PO2 a un livello quasi costante per ore o giorni.
Il microrespirometro coulometrico utilizzato in questo studio impiega un sensore elettronico multimodale (pressione, temperatura e umidità). Il sensore è azionato da un microcontrollore che rileva piccole variazioni di pressione e attiva la generazione di O2 quando viene raggiunta una soglia di bassa pressione12. Questo apparecchio è assemblato da parti standard, può essere utilizzato con un’ampia varietà di camere e ambienti sperimentali ed è stato impiegato con successo per esaminare gli effetti della massa corporea e della temperatura sul coleottero Tenebrio molitor. Nel presente studio, il microrespirometro è stato adattato per misurare il consumo di O2 in D. melanogaster, che ha circa l’1% della massa di T. molitor. La sensibilità dell’apparecchio è stata aumentata riducendo la soglia per l’attivazione della generazione di O2 e la stabilità ambientale è stata migliorata conducendo esperimenti in un bagno d’acqua a temperatura controllata e mantenendo l’umidità all’interno delle camere al 100% o quasi.
La proteina CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), parte della famiglia delle guanilate chinasi associate alla membrana (MAGUK), è un’impalcatura molecolare in diversi complessi multi-proteici e le mutazioni in CASK sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico nell’uomo e in D. melanogaster13,14. Un mutante vitale di D. melanogaster, CASKΔ18, interrompe l’attività dei neuroni dopaminergici 15 e riduce i livelli di attività di oltre il 50% rispetto ai controlli congenici14,16. A causa dei ridotti livelli di attività dei mutanti CASK e del ruolo delle catecolamine nella regolazione del metabolismo17 abbiamo ipotizzato che il loro tasso metabolico standard, e quindi il consumo di O2, sarebbe drasticamente ridotto rispetto ai controlli.
Il consumo di O2 è stato misurato in CASKΔ18 e nei loro congeneri wildtype, w(ex33). Gruppi di mosche sono stati collocati in camere di respirometria, è stato misurato il consumo di O 2, il consumo di O2 è stato calcolato ed espresso sia su base massa-specifica che per mosca. L’apparato ha registrato VO2 nei moscerini wildtype che era coerente con gli studi precedenti e ha potuto differenziare tra il consumo di O2 per mosca dei moscerini wildtype e dei moscerini mutanti CASK.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura di cui sopra mostra la misurazione del consumo di O2 in D. melanogaster utilizzando un microrespirometro coulometrico elettronico. I dati risultanti per il consumo di O2 in D. melanogaster wild-type erano all’interno degli intervalli descritti nella maggior parte delle pubblicazioni precedenti utilizzando metodi diversi (Tabella 1), anche se leggermente inferiori a quelli riportati da altri 3,6.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Dott.ssa Linda Restifo dell’Università dell’Arizona per aver suggerito di testare il consumo di O2 dei mutanti CASK e per l’invio dei mutanti CASK e dei loro controlli congeniti. Le spese di pubblicazione sono state fornite dal Fondo di reinvestimento dipartimentale del Dipartimento di Biologia dell’Università di College Park. Lo spazio e alcune attrezzature sono stati forniti dalle Università di Shady Grove.
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
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