Mensuração do Consumo de O2 em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

Summary

A respirometria coulométrica é ideal para medir a taxa metabólica de pequenos organismos. Quando adaptado para Drosophila melanogaster no presente estudo, o consumo medido de O₂ estava dentro da faixa relatada para D. melanogaster selvagem por estudos anteriores. O consumo por mosca O₂ pelos mutantes CAS , que são menores e menos ativos, foi significativamente menor do que o selvagem.

Abstract

A microrrespirometria coulométrica é um método simples e barato para medir o consumo de O₂ de pequenos organismos, mantendo um ambiente estável. Um microrrespirômetro coulométrico consiste em uma câmara hermética na qual o O 2 é consumido e o CO₂ produzido pelo organismo é removido por um meio absorvente. A diminuição de pressão resultante desencadeia a produção eletrolítica de O 2, e a quantidade de O₂ produzida é medida registrando-se a quantidade de carga usada para gerá-la. No presente estudo, o método foi adaptado para Drosophila melanogaster testado em pequenos grupos, com a sensibilidade do aparelho e as condições ambientais otimizadas para alta estabilidade. A quantidade de O₂ consumida por moscas selvagens neste aparelho é consistente com a medida por estudos anteriores. O consumo de_O2 específico em massa pelos mutantes CARSK, que são menores e sabidamente menos ativos, não foi diferente dos controles congênicos. No entanto, o pequeno tamanho dos mutantes CASK resultou em uma redução significativa no consumo de O₂ por mosca. Portanto, o microrrespirômetro é capaz de medir o consumo de O₂ em D. melanogaster, pode distinguir diferenças modestas entre genótipos e adiciona uma ferramenta versátil para medir taxas metabólicas.

Introduction

A capacidade de medir a taxa metabólica é crucial para uma compreensão completa de um organismo em seu contexto ambiental. Por exemplo, é necessário medir a taxa metabólica para entender seu papel no tempo de vida¹, o papel da dieta no metabolismo² ou o limiar para o estresse hipóxico³.

Existem duas abordagens gerais para medir a taxa metabólica⁴. A calorimetria direta mede o gasto energético diretamente medindo a produção de calor. A calorimetria indireta mede a produção de energia por outros meios, muitas vezes por meio da medição respirométrica do consumo de O 2 (V_O2), produção de CO₂ ou ambos. Embora a calorimetria direta tenha sido aplicada a pequenos ectotérmicos, incluindo Drosophila melanogaster⁵, a respirometria é tecnicamente mais simples e mais comumente usada.

Várias formas de respirometria têm sido usadas com sucesso para medir a taxa metabólica em D. melanogaster selvagem e mutante e têm fornecido informações sobre os efeitos metabólicos da temperatura⁶, ambiente social 3, dieta ^{3,7 e distúrbios} do neurodesenvolvimento⁸. Estes dividem-se em duas classes, que variam consideravelmente em custo e complexidade. A manometria é a mais simples e barata ^9,10, na qual as moscas são colocadas em uma câmara selada que contém um absorvente de CO₂ e que é conectada através de um capilar fino a um reservatório de fluido. À medida que o O 2 é consumido e o CO₂ absorvido, a pressão na câmara diminui e o fluido é atraído para o capilar. O volume preenchido por líquido do capilar é, portanto, proporcional ao V_O2. Versões mais elaboradas, que compensam a força exercida pelo fluido no capilar, também têm sido utilizadas em D. melanogaster¹. A manometria tem as vantagens de ser simples e barata, mas, por ser sensível à pressão, requer condições ambientais constantes. Além disso, como o O 2 consumido não é substituído, a pressão parcial de O₂ (P_O2) diminui gradualmente dentro das câmaras.

A respirometria usando análise de gases também é regularmente usada para D. melanogaster. Neste caso, os gases são amostrados em intervalos regulares a partir de câmaras seladas contendo moscas e enviados para um analisador infravermelho ^2,6,11. Esse tipo de aparelho tem as vantagens de estar disponível comercialmente, ser menos sensível às condições ambientais e os gases serem refrescados durante a amostragem para que o P_O2 permaneça estável. No entanto, o equipamento pode ser caro e complexo de operar.

Um microrrespirômetro coulométrico¹² recentemente desenvolvido fornece uma alternativa barata, sensível e estável aos sistemas existentes. Na prática, um organismo é colocado em uma câmara hermética onde consome O 2 e o CO₂ exalado é removido por um material absorvente, resultando em uma diminuição líquida na pressão da câmara. Quando a pressão interna diminui para um limiar pré-estabelecido (ON-threshold), a corrente é passada através de um gerador eletrolítico O₂, retornando a pressão para um segundo limiar (OFF-threshold) parando a eletrólise. A transferência de carga através do gerador de O 2 é diretamente proporcional à quantidade de O 2 necessária para repressurizar a câmara e, portanto, pode ser usada para medir o O₂ consumido pelo organismo⁴. O método é altamente sensível, mede V O2 com precisão, e a reposição regular de O₂ pode manter P_O2 em um nível quase constante por horas ou dias.

O microrrespirômetro coulométrico utilizado neste estudo emprega um sensor eletrônico multimodal (pressão, temperatura e umidade). O sensor é operado por um microcontrolador que detecta pequenas mudanças de pressão e ativa a geração de O₂ quando um limiar de baixa pressão é atingido¹². Este aparelho é montado a partir de peças de prateleira, pode ser usado com uma grande variedade de câmaras e ambientes experimentais, e tem sido empregado com sucesso para examinar os efeitos da massa corporal e temperatura sobre o besouro Tenebrio molitor. No presente estudo, o microrrespirômetro foi adaptado para medir o consumo de O₂ em D. melanogaster, que possui aproximadamente 1% da massa de T. molitor. A sensibilidade do aparelho foi aumentada pela redução do limiar de ativação da geração de O₂ , e a estabilidade ambiental foi melhorada pela realização de experimentos em banho-maria com temperatura controlada e pela manutenção da umidade no interior das câmaras em ou perto de 100%.

A proteína CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), parte da família das guanilato quinases associadas à membrana (MAGUK), é um arcabouço molecular em diferentes complexos multiproteicos, e mutações no CASK estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento em humanos e em D. melanogaster^13,14. Um mutante viável de D. melanogaster, CASK^Δ18, interrompe a atividade de neurônios dopaminérgicos 15 e reduz os níveis de atividade em mais de 50% em comparação com controles congênicos^14,16. Devido aos níveis reduzidos de atividade dos mutantes CASK e ao papel das catecolaminas na regulação do metabolismo¹⁷, levantamos a hipótese de que sua taxa metabólica padrão e, portanto, o consumo de O₂, seriam drasticamente reduzidos em comparação com os controles.

O consumo de O₂ foi medido em CASK^Δ18 e seus congêneres selvagens, w(ex33). Grupos de moscas foram colocados em câmaras de respirometria, o consumo de O 2 foi medido, o consumo de O₂ foi calculado e expresso em uma base específica de massa e por mosca. O aparelho registrou V_O2 em moscas selvagens que foi consistente com estudos anteriores, e poderia diferenciar entre o consumo por mosca O₂ de moscas selvagens e mutantes CARK.

Protocol

1. Criação e coleta de moscas Manter as moscas a 25 °C em frascos para injetáveis estreitos contendo alimentos padrão de Drosophila .NOTA: O tamanho da amostra para cada genótipo deve incluir pelo menos nove repetições, cada uma consistindo de uma única câmara respiratória contendo 15-25 moscas, configuradas conforme descrito abaixo. Transfira as moscas a cada 2-3 dias. Anestesiar moscas com CO2, coletar grupos de 15-25 machos de cada genó…

Representative Results

As saídas de pressão e corrente do controlador do respirômetro são mostradas para uma câmara em um experimento na Figura 3A. O primeiro pulso de corrente longa pressurizou a câmara da pressão ambiente (aproximadamente 992 hPa) até o limiar OFF pré-estabelecido de 1017 hPa. À medida que as moscas consumiam O 2 e CO 2 era absorvido, a pressão diminuía lentamente até atingir o limiar de ON de 1016 hPa, que ativava a corrente através do gerador de O2.</su…

Discussion

O procedimento acima demonstra a medição do consumo de O₂ em D. Melanogaster usando um microrrespirômetro coulométrico eletrônico. Os dados resultantes para o consumo de O₂ em D. melanogaster selvagem estavam dentro dos intervalos descritos na maioria das publicações anteriores usando diversos métodos (Tabela 1), embora um pouco menores do que os relatados por outros ^3,6.

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Materials

19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers