Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) משמש ככלי נפוץ למניפולציה של גנומים צמחיים. עם זאת, A. tumefaciens מפגינים יכולת העברת גנים למגוון רחב של מינים. למיני מיקרו-אצות רבים חסרות שיטות מבוססות היטב לשילוב אמין של גנים מעניינים בגנום הגרעיני שלהם. כדי לרתום את היתרונות הפוטנציאליים של ביוטכנולוגיה מיקרו-אצות, כלים פשוטים ויעילים למניפולציה גנומית הם חיוניים. כאן, פרוטוקול AMT ממוטב מוצג עבור מיני מיקרו-אצות תעשייתיות Chlorella vulgaris, תוך שימוש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (mGFP5) ובסמן העמידות לאנטיביוטיקה עבור Hygromycin B. מוטנטים נבחרים באמצעות ציפוי על מדיה Tris-אצטט-פוספט (TAP) המכילה Hygromycin B ו cefotaxime. ביטוי של mGFP5 מכומת באמצעות פלואורסצנטיות לאחר יותר מעשרה דורות של תת-תרבית, מה שמצביע על השינוי היציב של קלטת T-DNA. פרוטוקול זה מאפשר ייצור אמין של מושבות C. vulgaris טרנסגניות מרובות תוך פחות משבועיים, תוך שימוש בווקטור ביטוי הצמחים pCAMBIA1302 הזמין מסחרית.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, חיידק גראם-שלילי הנישא בקרקע, הוא בעל יכולת העברת גנים בין-מלכותית ייחודית, מה שזיכה אותו בתואר “מהנדס גנטי טבעי”1. חיידק זה יכול להעביר DNA (T-DNA) מפלסמיד הגורם לגידול (Ti-Plasmid) לתאים מארחים באמצעות מערכת הפרשת סוג IV, וכתוצאה מכך אינטגרציה וביטוי של T-DNA בתוך הגנום המארח 1,2,3,4. בסביבה הטבעית, תהליך זה מוביל להיווצרות גידולים בצמחים, הידוע בכינויו מחלת כיס המרה. עם זאת, אגרובקטריום יכול גם להעביר T-DNA לאורגניזמים שונים אחרים, כולל שמרים, פטריות, אצות, עוברים של קיפודי ים, ואפילו תאים אנושיים בתנאי מעבדה 5,6,7,8.
תוך ניצול מערכת טבעית זו, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) מאפשר שילוב אקראי של גנים מעניינים לתוך הגנום הגרעיני של התא המארח על ידי שינוי אזור T-DNA של Ti-plasmid. למטרה זו, וקטור ביטוי צמח AMT בשימוש נרחב הוא pCAMBIA13029. חוקרים יכולים להשתמש בתהליכי שיבוט פשוטים ב- E. coli לפני העברת הווקטור הרצוי ל- A. tumefaciens לצורך העברה לאחר מכן למארח העניין.
מיקרו-אצות ירוקות הן איקריוטים שחולקים קווי דמיון רבים עם צמחי יבשה, אך הם עקשנים מאוד לשינוי גנטי. עם זאת, טרנספורמציה גנטית ממלאת תפקיד מכריע במחקר בסיסי וביוטכנולוגי של מיקרו-אצות. בכמה מיני מיקרו-אצות, במיוחד Chlamydomonas reinhardtii, טרנספורמציה גנטית באמצעות AMT החדירה בהצלחה טרנסגנים כגון אינטרלוקין-2 אנושי (hIL-2), תחום קשירת קולטן קורונה 2 (SARS-CoV-2 RBD), ושני פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs)10,11,12,13. בין אלה, Chlorella vulgaris, מין אצות ירוקות פחות קפדני וגדל במהירות, טומן בחובו פוטנציאל משמעותי לייצור בר-קיימא של פחמימות, חלבונים, חומרים מזינים, פיגמנטים ותרכובות אחרות בעלות ערך גבוה14. עם זאת, היעדר כלים אמינים ליצירת זנים טרנסגניים של C. vulgaris מעכב את התקדמותה המסחרית. מאחר שפורסמו רק מספר מוגבל של עבודות המשתמשות ב-AMT ב-C. vulgaris15, ובהתחשב בהבדלים הניכרים בין גידול צמחים למיקרו-אצות, אופטימיזציה של פרוטוקול AMT הופכת חיונית.
במחקר זה, החוקרים הכניסו חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP5) במורד הזרם של מקדם וירוס פסיפס הכרובית (CamV) 35S והוסיפו תג היסטידין כדי להשתמש בו כגן כתב לביטוי חלבונים. טרנספורמטורים נבחרו באמצעות היגרומיצין B, ולאחר תרבית משנה במשך למעלה מעשרים דורות, השינוי נשאר יציב. פלסמיד pCAMBIA1302 המשמש בעבודה זו יכול להיות מותאם בקלות להכיל כל גן מעניין. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה והחומרים המוצגים למיני אצות ירוקות אחרות עם מקדם CamV35S פעיל, מכיוון שמקדם זה משמש לבחירת היגרומיצין.
Protocol
Representative Results
Discussion
יעילות הטרנספורמציה קשורה למספר פרמטרים שונים. הבחירה בזני A. tumefaciens המשמשים ל- AMT היא קריטית. AGL-1 הוא אחד הזנים הפולשים ביותר שהתגלו, ומסיבה זו נעשה בו שימוש שגרתי ב-AMT צמחי. תוספת של גלוקוז (15-20 מילימול) חשובה גם היא ליעילות AMT. בהתחשב בכך ש-C. vulgaris יכול לגדול הן בתנאים פוטוטרופיים והן …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לפרופ’ פול הויקאס על שסיפק באדיבותו את וקטור pCAMBIA1302 ואת Agrobacterium tumefaciens AGL1 מהמכון לביולוגיה בליידן, אוניברסיטת ליידן, הולנד. המחברים רוצים גם להודות לאווה קוליק על עזרתה בגידול טרנספורמטורים פלואורסצנטיים. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ותוכנית Mitacs Accelerate.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023)
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
