Agrobacterium tumefaciens-Ingeniería genética mediada por microalgas verdes, Chlorella vulgaris
Summary
Este protocolo describe la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar genes de interés en el genoma nuclear de la microalga verde Chlorella vulgaris, lo que conduce a la producción de transformantes estables.
Abstract
La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) sirve como una herramienta ampliamente empleada para manipular los genomas de las plantas. Sin embargo, A. tumefaciens exhibe la capacidad de transferencia génica a una amplia gama de especies. Numerosas especies de microalgas carecen de métodos bien establecidos para integrar de forma fiable genes de interés en su genoma nuclear. Para aprovechar los beneficios potenciales de la biotecnología de microalgas, es crucial contar con herramientas de manipulación genómica sencillas y eficientes. En este trabajo, se presenta un protocolo de AMT optimizado para la especie de microalga industrial Chlorella vulgaris, utilizando la proteína fluorescente verde reportera (mGFP5) y el marcador de resistencia a antibióticos para la higromicina B. Los mutantes se seleccionan mediante siembra en medios de tris-acetato-fosfato (TAP) que contienen higromicina B y cefotaxima. La expresión de mGFP5 se cuantifica a través de la fluorescencia después de más de diez generaciones de subcultivo, lo que indica la transformación estable del casete de ADN-T. Este protocolo permite la generación confiable de múltiples colonias transgénicas de C. vulgaris en menos de dos semanas, empleando el vector de expresión vegetal pCAMBIA1302 disponible comercialmente.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, una bacteria gramnegativa transmitida por el suelo, posee una capacidad única de transferencia de genes entre reinos, lo que le valió el título de “ingeniero genético natural”1. Esta bacteria puede transferir ADN (ADN-T) de un plásmido inductor de tumores (Plásmido Ti) a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo IV, lo que resulta en la integración y expresión del ADN-T dentro del genoma del huésped 1,2,3,4. En el entorno natural, este proceso conduce a la formación de tumores en las plantas, comúnmente conocida como enfermedad de la agalla de la corona. Sin embargo, Agrobacterium también puede transferir ADN-T a otros organismos, como levaduras, hongos, algas, embriones de erizo de mar e incluso células humanas en condiciones de laboratorio 5,6,7,8.
Aprovechando este sistema natural, la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) permite la integración aleatoria de genes de interés en el genoma nuclear de una célula huésped mediante la modificación de la región de ADN-T del plásmido Ti. Para este propósito, un vector de expresión de plantas AMT ampliamente utilizado es pCAMBIA13029. Los investigadores pueden emplear flujos de trabajo de clonación simples en E. coli antes de transferir el vector deseado a A. tumefaciens para su posterior transferencia al huésped de interés.
Las microalgas verdes son eucariotas que comparten muchas similitudes con las plantas terrestres, pero son muy recalcitrantes a la modificación genética. Sin embargo, la transformación genética desempeña un papel crucial tanto en la investigación fundamental como en la biotecnológica de las microalgas. En varias especies de microalgas, en particular Chlamydomonas reinhardtii, la transformación genética a través de AMT ha introducido con éxito transgenes como la interleucina-2 humana (hIL-2), el dominio de unión al receptor 2 del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2 RBD) y dos péptidos antimicrobianos (AMP)10,11,12,13. Entre ellas, Chlorella vulgaris, una especie de alga verde menos exigente y de rápido crecimiento, tiene un potencial significativo para la producción sostenible de carbohidratos, proteínas, nutracéuticos, pigmentos y otros compuestos de alto valor14. Sin embargo, la falta de herramientas confiables para crear cepas transgénicas de C. vulgaris obstaculiza su progreso comercial. Dado que solo ha habido un número limitado de trabajos publicados que utilizan AMT en C. vulgaris15, y dadas las considerables diferencias entre el cultivo de plantas y microalgas, la optimización del protocolo AMT se vuelve esencial.
En este estudio, los investigadores insertaron la proteína verde fluorescente (mGFP5) aguas abajo del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CamV) y agregaron una etiqueta de histidina para usarla como gen reportero para la expresión de proteínas. Los transformantes se seleccionaron utilizando higromicina B, y después de un subcultivo durante más de veinte generaciones, la transformación se mantuvo estable. El plásmido pCAMBIA1302 empleado en este trabajo se puede adaptar fácilmente para contener cualquier gen de interés. Además, el método y los materiales presentados se pueden ajustar para otras especies de algas verdes con un promotor activo CamV35S, ya que este promotor se utiliza para la selección de higromicina.
Protocol
Representative Results
Discussion
La eficiencia de la transformación está asociada a varios parámetros diferentes. La elección de las cepas de A. tumefaciens utilizadas para AMT es crucial. AGL-1 es una de las cepas más invasivas descubiertas y, por esta razón, se ha utilizado de forma rutinaria en la AMT de las plantas. La suplementación de los medios de inducción con glucosa (15-20 mM) también es importante para la eficiencia de la AMT. Teniendo en cuenta que C. vulgaris puede crecer tanto en condiciones fototróficas como he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Prof. Paul Hooykaas por proporcionar amablemente el vector pCAMBIA1302 y Agrobacterium tumefaciens AGL1 del Instituto de Biología de Leiden, Universidad de Leiden, Países Bajos. Los autores también quieren agradecer a Eva Colic por su ayuda en el cultivo de los transformadores fluorescentes. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y el programa Mitacs Accelerate.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
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