Dette papiret presenterer en detaljert protokoll for oppdrett av kålhvit sommerfugl i kontrollerte laboratorieforhold med et kunstig diett, som tillater presise manipulasjoner av tidlig ernæring og toksineksponering. De representative resultatene viser hvordan tungmetalltoksisitet kan analyseres med denne protokollen.
Kålhvitsommerfugl (Pieris rapae) er et viktig system for anvendt skadedyrbekjempelsesforskning og grunnforskning innen atferds- og ernæringsøkologi. Kålhvitt kan lett oppdrettes under kontrollerte forhold på en kunstig diett, noe som gjør dem til en modellorganisme i sommerfuglverdenen. I denne artikkelen brukes en manipulering av tungmetalleksponering for å illustrere grunnleggende metoder for oppdrett av denne arten. Den generelle protokollen illustrerer hvordan sommerfugler kan fanges i felt, induseres til å legge egg i drivhusbur, og overføres som larver til kunstige dietter. Metodene viser hvordan sommerfugler kan merkes, måles og studeres for en rekke forskningsspørsmål. De representative resultatene gir en ide om hvordan kunstige dietter som varierer i komponenter, kan brukes til å vurdere sommerfuglytelsen i forhold til et kontrolldiett. Nærmere bestemt var sommerfugler mest tolerante mot nikkel og minst tolerante mot kobber, med en toleranse for sink et sted i midten. Mulige forklaringer på disse resultatene diskuteres, inkludert nikkel hyperakkumulering i noen sennepsvertsplanter og nyere bevis hos insekter at kobber kan være mer giftig enn tidligere verdsatt. Til slutt vurderer diskusjonen først variasjoner i protokollen og instruksjonene for feilsøking av disse metodene, før man vurderer hvordan fremtidig forskning kan optimalisere det kunstige kostholdet som brukes i denne studien. Samlet sett, ved å gi en detaljert videooversikt over oppdrett og måling av kålhvite på kunstige dietter, gir denne protokollen en ressurs for bruk av dette systemet på tvers av et bredt spekter av studier.
Den lille kålhvite sommerfuglen (Pieris rapae, heretter “kålhvit”) er en kosmopolitisk skadedyrart av sennepsavlinger, som kål, brokkoli og raps 1,2,3. Samtidig er kålhviten et kraftig system for forskning i biologi og en vanlig brukt sommerfuglmodell, da de lett kan oppdrettes og manipuleres i kontrollerte laboratorieforsøk 4,5. Forskning på kålhvite sommerfugler har gitt kritisk innsikt med hensyn til vertssøk 6,7,8, nektarressursbruk 9,10,11, kompisvalg og seksuell seleksjon 12,13,14, vingemønsterutvikling og evolusjon15,16,17, og respons på nye og skiftende Miljøer18,19. Mange av disse innsiktene er avhengige av det faktum at kålhvite kan oppdrettes på kunstige dietter 4,20,21, som nøyaktig kan manipuleres for å gjenspeile dårlige ernæringsforhold 22,23, økologisk relevante forurensningsnivåer 24,25,26,27, eller overganger til nye vertsplanter28,29. Denne studien bruker et eksperiment på eksponering for tungmetaller for å illustrere grunnleggende metoder for oppdrett av kålhvite sommerfugler på en kunstig diett i laboratoriet og viktige ytelsesmål for larver og voksne. Mange aspekter av disse metodene gjelder for andre sommerfugler30,31 og møll32,33,34 som kan oppdrettes på en kunstig diett.
I dette papiret brukes et eksperiment på metalltoleranse for å illustrere de generelle metodene for oppdrett av kålhvite sommerfugler. Tungmetaller er et vanlig menneskeskapt forurensende stoff som stammer fra nedbrytning av menneskelige produkter, industrielle prosesser og eldre forurensning fra historisk bruk i plantevernmidler, maling og andre produkter35,36,37,38. Mange tungmetaller, inkludert bly, kobber, sink og nikkel, kan bevege seg fra jord og vann til plantevev 39,40,41,42, og metaller i støv kan avsettes på planteblader43,44,45, noe som resulterer i flere eksponeringsveier for fytofagøse insektlarver. Tungmetalleksponering tidlig i livet kan ha negative effekter på dyrs utvikling, spesielt på nevralvev, og høye nivåer kan være dødelige 35,36,46,47,48. En rekke studier har vist de negative effektene av metalleksponering på utviklende insekter, inkludert både og gunstige insekter 49,50,51. Det store antallet tungmetallforurensninger, og det faktum at de ofte forekommer samtidig i menneskelige miljøer52, betyr at det er behov for nøyaktige laboratoriemetoder der forskere kan utsette utviklende insekter for forskjellige nivåer og kombinasjoner av forskjellige metaller for å forstå og redusere deres miljøeffekter.
Det nåværende arbeidet kontrasterer virkningen av vanlige metaller på kålhvit overlevelse og utvikling, med fokus på kobber (Cu), sink (Zn) og nikkel (Ni), tre vanlige forurensninger i menneskelige miljøer. For eksempel inneholder forbs fra landlige veikanter i Minnesota opptil 71 ppm Zn, 28 ppm Cu og 5 ppm Ni53. Dette eksperimentet manipulerer nivåene av disse metallene i kunstige dietter av kålhvite sommerfugler på nivåer som tilsvarer og overstiger nivåene sett i miljøet. Et kunstig diett brukes til å kontrastere den relative toksisiteten til disse metallene, og forutsi at kålhvite ville være mer følsomme for metallforurensninger som ikke er en integrert del av deres fysiologi (nikkel) i forhold til de som oppstår, om enn i små nivåer, i enzymer og vev (kobber og sink; Figur 1). Gjennom hele denne teksten gir metodologiske detaljer og tilhørende videovisualiseringer for å illustrere oppdretts- og forskningsmetodene til dette viktige sommerfuglmodellsystemet.
I denne undersøkelsen ble kålhvite sommerfugler (Pieris rapae) oppdratt på en kunstig diett for å undersøke forskjeller i tungmetalltoksisitet. På den måten gir denne studien generelle metoder for oppdrett og laboratorieundersøkelser av dette lett å manipulere sommerfuglsystemet. Denne diskusjonen vurderer først mer generelle spørsmål om metodene som er gjennomgått her, og gjennomgår deretter våre vitenskapelige funn før vi avslutter med refleksjoner om komponentene i det kunstige dietten.
Protokollen som er gjennomgått her gir trinn i en generell oppdrettsmetode for kålhvite sommerfugler, men det er mange punkter i denne protokollen som kan justeres. For eksempel, mens casestudien som presenteres her, bruker svamper til fôring, har andre forskere hatt flaks med tannveker og silkeblomster fylt med honningvann5. Mens denne studien bruker honningvann som mat, har andre forskere brukt sukkerløsninger og til og med Gatorade. Hvis pupper må veies, eller flyttes til andre forhold for fremvekst (f.eks. indusere diapause og trenger å kjølelagre i 1 måned), kan forskeren enkelt fjerne dem fra koppene ved å sprite dem med vann for å fukte silkevedleggene og ta tak i dem med fjærtang, og deretter henge dem på nytt ved hjelp av dobbeltsidig tape. Hvis forskere trenger mer fleksibilitet når det gjelder når voksne sommerfugler flyttes inn i bur for voksenadferd, kan de holdes i kjøleskapet i flere uker, men de må mates. Hver flere dager skal sommerfuglene tas ut for å bli matet en fortynnet honningvannsløsning. Under innendørs belysning kan dette gjøres ved å bruke en pinne for å rulle ut snabelen i maten. På den voksne ytelsessiden kan et bredt spekter av treningstiltak tas på kålhvite sommerfugler. Kroppsstørrelse kan måles som den våte eller tørre massen av larver på bestemte stadier, pupper eller voksne (ofret, eller holdt i glassinkonvolutter), eller gjennom måling av vingelengde i programmet ImageJ (se 12,24,25,28). Hunnens levetidsfruktbarhet kan måles gjennom daglige eggsamlinger på vertsplanter 25,69,70, og størrelsen på spesifikke egenskaper kan måles som en beregning av ytelse; For eksempel massen eller volumet av hjernen eller individuelle hjernegrupper 62,71,72, eller massen eller proteininnholdet i thorax eller flymuskelen 62,70. Endelig kan voksne brukes i atferdsstudier for å teste et hvilket som helst antall spørsmål som undersøker effekten av diettmanipulasjon på foraging eller oviposisjonsvalg 27,73.
Hvis oppdrettsprotokollen ikke fungerer som forventet, er det noen aspekter å feilsøke. Først kan man spørre om lysnivåene er høye nok til å fremkalle normal voksenadferd. Mens laboratorietilpassede linjer av Pieris vil legge egg under fluorescerende lys, er det eneste kunstige lyset som fungerer for villtypelinjer kraftige bredspektrede drivhuslys. Naturlig lys i drivhus, vinduskarmer eller utendørs fungerer best for å fremkalle parring og eggleggingsadferd. For det andre, hvis egg ikke klekkes eller hvis larver dør tidlig i utviklingen, er det noen ting du bør vurdere. Vertsplantematerialet må være organisk, og merk at “organiske” planter fra butikkene noen ganger behandles med kjemikalier som kan drepe larver, så det er ofte best å heve sine egne vertsplanter. Hvis vertsakseptgraden er lavere, kan yngre blader med høyere nitrogeninnhold forsøkes, presentere potteplanter i stedet for individuelle blader og sikre at kvinner blir parret. Hunnene vil akseptere såing Brassica, selv små spirer som er 2 uker gamle. Parafinmetoden fungerer bra for å overføre egg til forskjellige forhold, men det skal bemerkes at akseptgraden har en tendens til å være lavere enn hele planter. For det tredje må alle komponentene i dietten være av høy kvalitet og ikke utløpt. Linfrøolje bør byttes årlig og lagres i kjøleskapet24,25. Hvetekim, vitaminblandingen og antibiotika bør også holdes kjølig. For det fjerde kan man vurdere å justere diettkoppoppsettet. Et hvilket som helst antall engangs plastkopptyper kan brukes til oppdrett, fra 1 oz til 15 oz. Vi har funnet ut at 4 oz er en god størrelse for å tillate voksen fremvekst og pakker pent inn i våre klimakamre. Hull poked i lokkene tillater luftstrøm, men for mange hull kan tørke dietten under lave luftfuktighetsforhold, så dette tallet må kanskje justeres. For det femte kan forholdene i klimakammeret måtte justeres i kombinasjon med koppforholdene. Hvis forholdene er for tørre, kan vertsplanter med egg tørke ut før larver kan overføres, og kopper med diett kan tørke ut før sommerfugler dukker opp. På den annen side, hvis forholdene er for våte, kan koppene havne mugg og sykdom. Forskere må kanskje justere luftstrømmen i kopper ved bruk av nettinglokk, eller mer eller mindre hull i lokkene. Et annet vanlig problem er kammerlys som er lyse nok til å forårsake temperatursvingninger i koppene og en oppbygging av kondens; Å bruke dimmerlys er et enkelt alternativ for larveoppdrett.
Med hensyn til forskningsspørsmålene i denne artikkelen, fant denne studien at kålhvite var relativt mer følsomme for kobber enn for nikkel eller sink. Kobber hadde signifikant negativ innvirkning på utviklingstid ved konsentrasjoner så lave som 50 ppm (figur 3 og tabell 3) og på overlevelse ved 500 ppm (figur 4, tabell 4). Derimot var det ingen negative effekter av nikkel på overlevelse (opptil 500 ppm; Figur 3) eller negative effekter på utviklingstid ved 100 ppm (figur 4). Kålhvite var ganske tolerante for sink, med overlevelseseffekter sett bare ved 1000 ppm (figur 3) og negative effekter på utviklingstid fra 100 ppm (figur 4). Basert på de relativt større konsentrasjonene av sink i sommerfuglvev og sennep (deres vertsplante; Figur 1), var det forventet at man ville se en relativt større toleranse for sink. Følsomheten for kobber og toleransen for nikkel var imidlertid noe uventet gitt de svært lave nivåene av nikkel i sommerfuglvev (figur 1) og nødvendigheten av kobber som mikronæringsstoff. Disse uventede funnene diskuteres nedenfor etter å ha vurdert toleransen til disse metallene i andre sommerfugler og møll.
For å sammenligne nåværende data med metallfølsomhet målt i andre Lepidoptera, ble data fra eksisterende studier samlet på minimumskonsentrasjonen, hvor tungmetaller påvirket overlevelsen negativt 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; Disse studiene fokuserte på møll, spesielt skadedyrsarter (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alle de målte sensitivitetsverdiene i denne studien ligger nær det som er målt for disse andre artene (figur 5). Imidlertid synes målet for nikkeltoleranse i denne studien å være høyere enn forventet – mens det ikke var en signifikant effekt av overlevelse ved 500 ppm, fant den forrige studien på Pieris rapae også en svært høy toleranse for nikkel (signifikante effekter som starter på 1000 ppm56), til tross for lave nivåer i vevet naturlig (figur 1). Målet på kobberfølsomhet i denne studien ser også ut til å være i den lave enden for studier av Lepidoptera. Mens bruk av et kunstig diett tillater en praktisk og kontrollert sammenligning av relativ metallfølsomhet, er det viktig å merke seg at komponenter i dietten kan endre måling av absolutt metallfølsomhet. For eksempel kan vitamin C i kostholdet kompensere for metallinducert oksidativt stress74, eller antibiotika i dietten kan endre eventuelle effekter av mikrober på behandling av metaller75. En interessant linje med fremtidig forskning ville være å systematisk manipulere slike diettkomponenter for å teste effekter på metalltoksisitet, spesielt gitt spørsmål om den funksjonelle rollen som lepidopteran tarmmikrober 76,77 og nektarkomponenter som kan ha antioksidantegenskaper78. I tillegg kan variasjon i diettbehov på tvers av arter gjøre interspesifikke sammenligninger utfordrende, og kunstige diettbaserte metoder bør suppleres med manipulasjoner av vertsplanter.
Disse sommerfuglene er spesielt tolerante for nikkel og følsomme for kobber. Tidligere forskning har bemerket at mange planter i sennepsfamilien, som inkluderer planter favorisert av Pieridae, hyperakkumulerer nikkel som en defensiv mekanisme mot planteetere 55,56,63,79,80,81. Denne hyperakkumuleringen er over 1000 ppm i plantevev, som er størrelsesordener større enn det som ses i de fleste planter (figur 1). Det er mulig at Pieris har en spesielt høy toleranse for nikkel på grunn av tidligere seleksjon av slike nikkelakkumulatorer, som tidligere spekulerti 26. Mens kobber har blitt sjeldnere studert som et mikronæringsstoff i insektdietter, er det noen bevis på at det spiller en liten rolle i reproduksjon og immunitet, men først og fremst i blodfôrende insekter (f.eks. 82,83). Det er mulig at kobber spiller en mindre viktig fysiologisk rolle hos sommerfugler enn hos andre dyr 84,85,86, i samsvar med nyere arbeid som fremhever hvordan kobber kan være like bekymringsfullt for et forurensende stoff for insekter som bly, kadmium og kvikksølv (f.eks. 87,88,89). Mens Pieris har vist seg å unngå kobberforurensning ved lave nivåer90, har mobiliteten av kobber i planter (f.eks. Flytter inn i blader og blomster) også flagget det som en metallforurensning av bekymring91.
Selv om disse resultatene gir interessante data om den relative toksisiteten til disse metallene til kålhvite sommerfugler, har dette papiret også som mål å være til generell bruk som en detaljert visuell illustrasjon av metoder for oppdrett av dette kraftige systemet. Kålhvite er enkle å oppdra og manipulere i kontrollerte laboratorieeksperimenter 4,5 som letter studier av vertssøk 6,7,8, foraging9,10,11 og seksuell seleksjon12,13,14. Evnen til å oppdra disse sommerfuglene på en kunstig diett er nøkkelen til å skape vanlige hageforhold for sammenligninger og å manipulere næringsstoffer, giftstoffer og til og med nye vertsplanter. Det er imidlertid viktig å merke seg at dette kunstige dietten ikke nødvendigvis er den optimale kunstige dietten for denne arten, og kan sannsynligvis forbedres med fremtidige manipulasjoner. For eksempel ble saltblandingen i denne dietten (og andre lepidopteran dietter) opprinnelig utviklet for vertebrater og har høyere kalsiumnivåer enn hva de fleste insekter trenger92,93. Dermed har noen av våre oppdrettsforsøk gjort tilpassede saltblandinger med lavere kalsiumnivåer (f.eks. 62), og andre bruker “Becks saltblanding”, som kan være mer passende for mange insektarter94. I våre egne manipulasjoner fant vi også at sommerfugler presterte bedre med relativt mindre hvetekim og relativt mer cellulose sammenlignet med opprinnelige konsentrasjoner4. Et område som trenger ytterligere oppmerksomhet er lipidkilden og konsentrasjonen i dietten. For eksempel har tidligere arbeid vist at skifting fra linolje (brukt i denne studien) til fosfolipider økte parringshastighetene og vekstratene til Pieris på kunstige dietter95. Tilskudd av spesifikke fettsyrer i kunstige dietter kan ha ytterligere positive effekter96,97. Optimalisering av den kunstige dietten til Pieris98,99 skaper muligheter for å ta opp interessante spørsmål om ernæringsmessig økologi 100,101,102, evolusjonær økologi og økotoksikologi. Disse kunstige dietttilnærmingene tillater forskere å ta opp spørsmål om rollen som spesifikke lipider i kognitiv evolusjon 103, pre-tilpasning til toksiner28, diettkomponenter som reduserer toksisiteten av forurensende stoffer 104 eller støkiometriske interaksjoner mellom næringsstoffer105.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for støtten fra bachelorassistenter under oppdragelsen for dette arbeidet, spesielt Regina Kurandina og Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski hjalp til med å samle litteratur om metalltoksisitet i andre Lepidoptera. Dette arbeidet ble gjort mulig av et University of Minnesota Department of Ecology, Evolution and Behavior sommerforskningsstipend.
1-L Pyrex beaker | Fisher Scientific | 07-250-059 | |
500 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 03-007-43 | |
60-mm plastic petri dish lid | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
Ascorbic Acid | Frontier | 6015 | |
Blender | Amazon – Ninja Store | BL610 Professional | |
Cabbage Flour | Frontier | 1086 | |
Casein | Frontier | 1100 | |
Celluose | Frontier | 3425 | |
Cholsterol | Sigma | C3045 | |
Cups for rearing (4 oz) | Wasserstrom | 6094583 | purchase with matching lids |
Fine Mesh Agar | Sigma | ||
Flaxseed Oil | amazon | B004R63VI6 | |
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch | Amazon – Yimaa Direct | B08BZ969DK | |
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) | Amazon – Wizard Coin Supply | B0045FG90G | |
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") | Amazon | B07SK6P94S | |
Methyl Paraben | Frontier | 7685 | |
Ohaus Portable Scale | Fisher Scientific | 02-112-228 | |
Organic Honey | Amazon | B07DHQQFGM | |
Photo studio portable lightbox | Amazon | B07T6TNYJ1 | |
Plastic bin, shoebox size | Amazon | B09L3B3V1R | |
Plastic disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-680-50 | |
Sorbic Acid | Sigma | S1626 | |
Spatulas | Fisher Scientific | 14-357Q | |
Streptomycin | Sigma | S9137 | |
Sucrose | Target | ||
Torula Yeast | Frontier | 1720 | |
Vanderzant vitamin mix | Frontier | F8045 | |
Weigh boats | Fisher Scientific | 01-549-750 | |
Wesson Salt Mix | Frontier | F8680 | |
Wheat Germ | Frontier | G1659 | |
Wooden handled butterfly net, 12" hoop | Amazon – Educational Science | B00O5JDLVC | |
Yellow sponges | Amazon-Celox | B0B8HTHY5B |