La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal
Summary
Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.
Abstract
La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Debido a que las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar los comportamientos sensoriomotores, el estudio directo de las respuestas eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía existen algunas dificultades complejas para lograr este objetivo, incluido el mantenimiento de la viabilidad celular, la separación rápida de la médula espinal de la estructura ósea y el uso del SCS para inducir con éxito potenciales de acción. Aquí, presentamos un protocolo detallado que utiliza patch-clamp para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en la neurona motora y evitar pruebas y errores innecesarios.
Introduction
La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Andreas Rowald et al. informaron que el SCS permite la función locomotora y troncal de las extremidades inferiores en un solo día1. La exploración del mecanismo biológico del SCS para la recuperación locomotora es un campo de investigación crítico y de tendencia para desarrollar una estrategia de SCS más precisa. Por ejemplo, el equipo de Grégoire Courtine demostró que la interneurona excitadora Vsx2 y las neuronas Hoxa10 en la médula espinal son las neuronas clave para la respuesta al SCS, y la neuromodulación específica de la célula es factible para restaurar la capacidad de caminar de la rata después de la LME2. Sin embargo, pocos estudios se centran en el mecanismo eléctrico del SCS a escala de una sola célula. Aunque es bien sabido que el estímulo de corriente continua supraumbral puede provocar los potenciales de acción (AP) en el experimento clásico del calamar 3,4,5, aún no está claro cómo la estimulación eléctrica alterna pulsada, como la SCS, afecta a la generación de señales motoras.
Dada la complejidad de los circuitos neuronales intraespinales, la selección adecuada de la población celular es importante para investigar el mecanismo eléctrico del SCS. Aunque el SCS restaura la función motora mediante la activación de la vía propioceptiva6, las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar el comando motor, derivado de la integración de la información de la propiocepción de entrada aferente7. Por lo tanto, el estudio directo de las características eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal.
Como sabemos, el patch-clamp es el método de referencia para el registro electrofisiológico celular con una resolución espacio-temporal extremadamente alta8. Por lo tanto, este estudio describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS. En comparación con el parche cerebral9, el parche clamp de la médula espinal es más difícil debido a las siguientes razones: (1) La médula espinal está protegida por el canal vertebral con un volumen minúsculo, lo que requiere una micromanipulación muy fina y un riguroso mantenimiento en frío para obtener una mejor viabilidad celular. (2) Debido a que la médula espinal es demasiado delgada para asegurarla en la bandeja de corte, debe sumergirse en agarosa de bajo punto de fusión y recortarse después de la solidificación.
Por lo tanto, este método proporciona detalles técnicos para diseccionar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en las neuronas motoras y evitar pruebas y errores innecesarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
La información de movimiento modulada por el SCS finalmente converge a las neuronas motoras. Por lo tanto, tomar las neuronas motoras como objetivo de investigación puede simplificar el diseño del estudio y revelar el mecanismo de neuromodulación del SCS de manera más directa. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía exist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para Jóvenes Académicos (52207254 y 82301657) y el Fondo de Ciencias Postdoctorales de China (2022M711833).
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
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