التحضير خارج الجسم الحي لشريحة الحبل الشوكي لتسجيل المشبك التصحيحي للخلية الكاملة في الخلايا العصبية الحركية أثناء تحفيز الحبل الشوكي
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في وقت واحد.
Abstract
يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). نظرا لأن الخلايا العصبية الحركية هي الوحدة الأخيرة لتنفيذ السلوكيات الحسية الحركية ، فإن الدراسة المباشرة للاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية مع SCS يمكن أن تساعدنا في فهم المنطق الأساسي لتعديل الحركة الشوكية. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة لدراسة الخصائص الفيزيولوجية الكهربية على نطاق خلية واحدة. ومع ذلك ، لا تزال هناك بعض الصعوبات المعقدة في تحقيق هذا الهدف ، بما في ذلك الحفاظ على صلاحية الخلية ، وفصل الحبل الشوكي بسرعة عن البنية العظمية ، واستخدام SCS لتحفيز جهود الفعل بنجاح. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا باستخدام patch-clamp لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية ل SCS بدقة زمانية مكانية عالية ، والتي يمكن أن تساعد الباحثين على تحسين مهاراتهم في فصل الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في نفس الوقت لدراسة الآلية الكهربائية ل SCS بسلاسة على الخلايا العصبية الحركية وتجنب التجربة والخطأ غير الضروريين.
Introduction
يمكن لتحفيز الحبل الشوكي (SCS) استعادة الوظيفة الحركية بشكل فعال بعد إصابة الحبل الشوكي (SCI). أفاد Andreas Rowald et al. أن SCS تمكن الطرف السفلي من وظيفة المحرك والجذع في غضون يوم واحد1. يعد استكشاف الآلية البيولوجية ل SCS للتعافي الحركي مجالا بحثيا مهما وشائعا لتطوير استراتيجية SCS أكثر دقة. على سبيل المثال ، أظهر فريق Grégoire Courtine أن الخلايا العصبية البينية Vsx2 المثيرة والخلايا العصبية Hoxa10 في الحبل الشوكي هي الخلايا العصبية الرئيسية للاستجابة ل SCS ، والتعديل العصبي الخاص بالخلية ممكن لاستعادة قدرة الفئران على المشي بعد SCI2. ومع ذلك ، تركز دراسات قليلة على الآلية الكهربائية ل SCS على نطاق خلية واحدة. على الرغم من أنه من المعروف أن محفز التيار المباشر فوق العتبة يمكن أن يثير جهود الفعل (APs) في تجربة الحبار الكلاسيكية3،4،5 ، إلا أن كيفية تأثير التحفيز الكهربائي المتناوب النبضي ، مثل SCS ، على توليد إشارة المحرك لا يزال غير واضح.
نظرا لتعقيد الدوائر العصبية داخل العمود الفقري ، فإن الاختيار المناسب لسكان الخلايا مهم للتحقيق في الآلية الكهربائية ل SCS. على الرغم من أن SCS يستعيد الوظيفة الحركية عن طريق تنشيط مسار الحس العميق6 ، فإن الخلايا العصبية الحركية هي الوحدة النهائية لتنفيذ الأمر الحركي ، المستمدة من دمج معلومات استقبال الحس العميق7. لذلك ، يمكن أن تساعدنا الدراسة المباشرة للخصائص الكهربائية للخلايا العصبية الحركية مع SCS في فهم المنطق الأساسي لتعديل المحرك الشوكي.
كما نعلم ، فإن مشبك التصحيح هو الطريقة القياسية الذهبية للتسجيل الكهربي الخلوي بدقة زمانية مكانية عالية للغاية8. لذلك ، تصف هذه الدراسة طريقة تستخدم مشبك رقعة لدراسة الاستجابات الكهربائية للخلايا العصبية الحركية ل SCS. بالمقارنة مع مشبك رقعة الدماغ9 ، فإن مشبك رقعة الحبل الشوكي أكثر صعوبة للأسباب التالية: (1) الحبل الشوكي محمي بواسطة القناة الفقرية ذات الحجم الصغير ، الأمر الذي يتطلب معالجة دقيقة للغاية وصيانة صارمة للجليد للحصول على صلاحية أفضل للخلايا. (2) نظرا لأن الحبل الشوكي نحيف جدا بحيث لا يمكن تثبيته على صينية القطع ، فيجب غمره في أغاروز منخفض نقطة الانصهار وتقليمه بعد التصلب.
ومن ثم ، توفر هذه الطريقة تفاصيل فنية في تشريح الحبل الشوكي والحفاظ على صلاحية الخلية في نفس الوقت وذلك لدراسة الآلية الكهربائية ل SCS بسلاسة على الخلايا العصبية الحركية وتجنب التجارب والأخطاء غير الضرورية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتقارب معلومات الحركة المعدلة بواسطة SCS أخيرا مع الخلايا العصبية الحركية. لذلك ، فإن أخذ الخلايا العصبية الحركية كهدف للبحث قد يبسط تصميم الدراسة ويكشف عن آلية التعديل العصبي ل SCS بشكل مباشر أكثر. لتسجيل خصائص التحفيز المتنوعة والاستجابات الخلوية في وقت واحد ، يعد مشبك التصحيح طريقة جيدة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين للعلماء الشباب (52207254 و 82301657) وصندوق علوم ما بعد الدكتوراه الصيني (2022M711833).
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
