Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada
Summary
Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.
Abstract
Com o avanço da microscopia multifóton e das tecnologias moleculares, a imagem por fluorescência está crescendo rapidamente para se tornar uma abordagem poderosa para estudar a estrutura, a função e a plasticidade dos tecidos cerebrais vivos. Em comparação com a eletrofisiologia convencional, a microscopia de fluorescência pode capturar a atividade neural, bem como a morfologia das células, permitindo registros de longo prazo das populações de neurônios identificadas em resolução unicelular ou subcelular. No entanto, imagens de alta resolução normalmente requerem uma configuração estável e fixa na cabeça que restringe o movimento do animal, e a preparação de uma superfície plana de vidro transparente permite a visualização de neurônios em um ou mais planos horizontais, mas é limitada no estudo dos processos verticais que atravessam diferentes profundidades. Aqui, descrevemos um procedimento para combinar uma fixação da placa cefálica e um microprisma que fornece imagens multicamadas e multimodais. Este preparo cirúrgico não apenas dá acesso a toda a coluna do córtex visual do camundongo, mas permite imagens de dois fótons em uma posição fixa da cabeça e imagens de um fóton em um paradigma de movimento livre. Usando essa abordagem, pode-se amostrar populações celulares identificadas em diferentes camadas corticais, registrar suas respostas sob estados de cabeça fixa e movimento livre, e rastrear as mudanças de longo prazo ao longo de meses. Assim, este método fornece um ensaio abrangente dos microcircuitos, permitindo a comparação direta das atividades neurais evocadas por estímulos bem controlados e sob um paradigma comportamental natural.
Introduction
O advento da imagem fluorescente in vivo de dois fótons 1,2, combinando as novas tecnologias em sistemas ópticos e indicadores de fluorescência geneticamente modificados, surgiu como uma técnica poderosa em neurociência para investigar a intrincada estrutura, função e plasticidade no cérebro vivo 3,4. Em particular, esta modalidade de imagem oferece uma vantagem incomparável sobre a eletrofisiologia tradicional por capturar tanto a morfologia quanto as atividades dinâmicas dos neurônios, facilitando o rastreamento em longo prazo dos neurônios identificados5,6,7,8.
Apesar de seus pontos fortes, a aplicação de imagens de fluorescência de alta resolução muitas vezes requer uma configuração estática e fixa na cabeça que restringe a mobilidade do animal 9,10,11. Além disso, o uso de uma superfície de vidro transparente para visualização de neurônios restringe as observações a um ou mais planos horizontais, limitando a exploração da dinâmica de processos verticais que se estendem por diferentes profundidades corticais12.
Abordando essas limitações, o presente estudo delineia um procedimento cirúrgico inovador que integra fixação da placa cefálica, microprisma e miniscópio para criar uma modalidade de imagem com capacidades multicamadas e multimodais. O microprisma permite observar o processamento vertical ao longo da coluna cortical 13,14,15,16, o que é fundamental para entender como a informação é processada e transformada à medida que se move através das diferentes camadas do córtex e como o processamento vertical é alterado durante as mudanças plásticas. Além disso, permite a obtenção de imagens das mesmas populações neurais em um paradigma de cabeça fixa e em um ambiente de movimento livre, englobando os versáteis cenários experimentais 17,18,19: por exemplo, a fixação da cabeça é frequentemente necessária para paradigmas bem controlados, como avaliação da percepção sensorial e registros estáveis sob o paradigma de 2 fótons, enquanto o movimento livre oferece um ambiente mais natural e flexível para estudos comportamentais. Portanto, a capacidade de realizar uma comparação direta em ambos os modos é crucial para aprofundar nossa compreensão dos microcircuitos que permitem respostas funcionais flexíveis.
Em essência, a integração da fixação da placa cefálica, microprisma e miniscópio em imagens de fluorescência oferece uma plataforma promissora para sondar os meandros da estrutura e funcionalidade do cérebro. Os pesquisadores podem amostrar populações celulares identificadas em várias profundidades que abrangem todas as camadas corticais, comparar diretamente suas respostas em paradigmas bem controlados e naturais e monitorar suas alterações de longo prazo ao longo dos meses20. Esta abordagem oferece informações valiosas sobre como essas populações neurais interagem e mudam ao longo do tempo sob diferentes condições experimentais, fornecendo uma janela para a natureza dinâmica dos circuitos neurais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, mostramos a capacidade de observar e comparar diretamente neurônios em condições de cabeça fixa e movimento livre nas mesmas populações neurais. Embora tenhamos demonstrado a aplicação no córtex visual, este protocolo pode ser adaptado a uma infinidade de outras áreas cerebrais, tanto áreas corticais quanto núcleos profundos24,25,26,27,28, bem como outras configurações comportamentais e de<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Sra. Charu Reddy e ao Professor Matteo Carandini (Cortex Lab) por seus conselhos sobre protocolo cirúrgico e compartilhamento de cepa de camundongo transgênico. Agradecemos ao Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) pela orientação e auxílio no desenvolvimento da cirurgia. Agradecemos à Sra. Andreea Aldea (Sun Lab) por sua assistência com a configuração cirúrgica e processamento de dados. Este trabalho foi apoiado pela Moorfields Eye Charity.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
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