Serbest Hareket Eden ve Kafası Sabit Hayvanlarda Mikroprizmalar Kullanılarak Tanımlanmış Nöral Popülasyonların Uzun Süreli Görüntülenmesi
Summary
Bir kafa plakası ve hem tek hem de iki fotonlu mikroskoplarla uyumlu bir optik tasarımla entegre edildiğinde, mikroprizma mercek, kafa sabit durumlarda iyi kontrol edilen deneyler veya serbestçe hareket eden hayvanlarda doğal davranışsal görevler dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında dikey bir sütundaki nöral tepkileri ölçmede önemli bir avantaj sunar.
Abstract
Çoklu foton mikroskobu ve moleküler teknolojilerin ilerlemesiyle, floresan görüntüleme, canlı beyin dokularının yapısını, işlevini ve plastisitesini incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmek için hızla büyüyor. Konvansiyonel elektrofizyoloji ile karşılaştırıldığında, floresan mikroskobu, hücrelerin morfolojisinin yanı sıra nöral aktiviteyi de yakalayabilir ve tanımlanan nöron popülasyonlarının tek hücreli veya hücre altı çözünürlükte uzun süreli kayıtlarını sağlar. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü görüntüleme tipik olarak, hayvanın hareketini kısıtlayan kararlı, kafaya sabitlenmiş bir kurulum gerektirir ve şeffaf camın düz bir yüzeyinin hazırlanması, nöronların bir veya daha fazla yatay düzlemde görselleştirilmesine izin verir, ancak farklı derinliklerde çalışan dikey süreçlerin incelenmesinde sınırlıdır. Burada, bir kafa plakası fiksasyonu ile çok katmanlı ve çok modlu görüntüleme sağlayan bir mikroprizmayı birleştirmek için bir prosedür açıklıyoruz. Bu cerrahi preparat, yalnızca fare görsel korteksinin tüm kolonuna erişim sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kafaya sabitlenmiş bir pozisyonda iki fotonlu görüntülemeye ve serbestçe hareket eden bir paradigmada bir fotonlu görüntülemeye izin verir. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı kortikal katmanlar boyunca tanımlanmış hücre popülasyonlarını örnekleyebilir, yanıtlarını kafa sabit ve serbestçe hareket eden durumlar altında kaydedebilir ve aylar boyunca uzun vadeli değişiklikleri izleyebilir. Bu nedenle, bu yöntem, iyi kontrol edilen uyaranlar tarafından ve doğal bir davranış paradigması altında uyandırılan sinirsel aktivitelerin doğrudan karşılaştırılmasını sağlayan mikro devrelerin kapsamlı bir tahlilini sağlar.
Introduction
Optik sistemlerdeki yeni teknolojileri ve genetiği değiştirilmiş floresan göstergelerini birleştiren in vivo iki fotonlu floresan görüntülemenin 1,2 ortaya çıkışı, canlı beyindeki karmaşık yapıyı, işlevi ve plastisiteyi araştırmak için sinirbilimde güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır 3,4. Özellikle, bu görüntüleme yöntemi, nöronların hem morfolojisini hem de dinamik aktivitelerini yakalayarak geleneksel elektrofizyolojiye göre benzersiz bir avantaj sunar ve böylece tanımlanan nöronların uzun süreli izlenmesini kolaylaştırır 5,6,7,8.
Kayda değer güçlü yönlerine rağmen, yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme uygulaması genellikle hayvanın hareketliliğini kısıtlayan statik, başa sabitlenmiş bir kurulum gerektirir 9,10,11. Ek olarak, nöronları görselleştirmek için şeffaf bir cam yüzeyin kullanılması, gözlemleri bir veya daha fazla yatay düzlemle sınırlandırarak, farklı kortikal derinliklere uzanan dikey süreçlerin dinamiklerinin keşfini sınırlar12.
Bu sınırlamaları ele alan bu çalışma, çok katmanlı ve çok modlu yeteneklere sahip bir görüntüleme modalitesi oluşturmak için kafa plakası fiksasyonu, mikroprizma ve miniskopu entegre eden yenilikçi bir cerrahi prosedürün ana hatlarını çizmektedir. Mikroprizma, kortikal kolon 13,14,15,16 boyunca dikey işlemenin gözlemlenmesine izin verir, bu da bilginin korteksin farklı katmanlarından geçerken nasıl işlendiğini ve dönüştürüldüğünü ve plastik değişimler sırasında dikey işlemenin nasıl değiştiğini anlamada kritik öneme sahiptir. Ayrıca, aynı nöral popülasyonların kafaya sabitlenmiş bir paradigmada ve serbestçe hareket eden bir ortamda görüntülenmesine izin verir, çok yönlü deneysel ortamlarıkapsar 17,18,19: örneğin, duyusal algı değerlendirmesi ve 2-foton paradigması altında kararlı kayıtlar gibi iyi kontrol edilen paradigmalar için genellikle kafa fiksasyonu gerekirken, serbestçe hareket etmek davranışsal çalışmalar için daha doğal, esnek bir ortam sunar. Bu nedenle, her iki modda da doğrudan karşılaştırma yapabilme yeteneği, esnek, işlevsel yanıtları mümkün kılan mikro devreler hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için çok önemlidir.
Özünde, kafa plakası fiksasyonu, mikroprizma ve miniskopun floresan görüntülemeye entegrasyonu, beynin yapısının ve işlevselliğinin inceliklerini araştırmak için umut verici bir platform sunar. Araştırmacılar, tüm kortikal katmanları kapsayan çeşitli derinliklerde tanımlanmış hücre popülasyonlarını örnekleyebilir, yanıtlarını hem iyi kontrol edilen hem de doğal paradigmalardaki yanıtlarını doğrudan karşılaştırabilir ve20 ay boyunca uzun vadeli değişikliklerini izleyebilir. Bu yaklaşım, bu nöral popülasyonların farklı deneysel koşullar altında zaman içinde nasıl etkileşime girdiğine ve değiştiğine dair değerli bilgiler sunarak, nöral devrelerin dinamik doğasına bir pencere sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, aynı nöral popülasyonlarda kafaya sabitlenmiş ve serbestçe hareket eden koşullarda nöronları gözlemleme ve doğrudan karşılaştırma yeteneğini gösterdik. Uygulamayı görsel kortekste göstermiş olsak da, bu protokol hem kortikal alanlar hem de derin çekirdekler 24,25,26,27,28 ve diğer veri toplama ve davranışsal kurulumlar <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Charu Reddy ve Profesör Matteo Carandini’ye (Cortex Lab) cerrahi protokol ve transgenik fare suşunun paylaşılması konusundaki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Dr Norbert Hogrefe’ye (Inscopix) ameliyatın geliştirilmesindeki rehberliği ve yardımı için teşekkür ederiz. Cerrahi kurulum ve veri işleme konusundaki yardımları için Bayan Andreea Aldea’ya (Sun Lab) teşekkür ederiz. Bu çalışma Moorfields Eye Charity tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
- Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
- Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
- Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
- Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
- Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
- Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
- Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
- Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
- Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
- Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
- Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
- Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
- Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
- Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
- Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
- Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
- Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
- Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).
