En multimodal, hurtig hyperspektral billeddannelsesramme blev udviklet for at opnå bredbåndsvibrationssumfrekvensgenerering (VSFG) billeder sammen med brightfield, anden harmonisk generation (SHG) billedbehandlingsmetoder. På grund af at den infrarøde frekvens resonans med molekylære vibrationer afsløres mikroskopisk strukturel og mesoskopisk morfologividen om symmetri-tilladte prøver.
Vibrational sum-frequency generation (VSFG), et andenordens ikke-lineært optisk signal, er traditionelt blevet brugt til at studere molekyler ved grænseflader som en spektroskopiteknik med en rumlig opløsning på ~ 100 μm. Spektroskopien er imidlertid ikke følsom over for heterogeniteten af en prøve. For at studere mesoskopisk heterogene prøver skubbede vi sammen med andre opløsningsgrænsen for VSFG-spektroskopi ned til ~ 1 μm niveau og konstruerede VSFG-mikroskopet. Denne billeddannelsesteknik kan ikke kun løse prøvemorfologier gennem billeddannelse, men også optage et bredbånds VSFG-spektrum ved hver pixel i billederne. Da den er en andenordens ikke-lineær optisk teknik, muliggør dens udvælgelsesregel visualisering af ikke-centrosymmetriske eller chirale selvmonterede strukturer, der almindeligvis findes inden for blandt andet biologi, materialevidenskab og bioteknologi. I denne artikel vil publikum blive guidet gennem et omvendt transmissionsdesign, der giver mulighed for billeddannelse af ikke-fikserede prøver. Dette arbejde viser også, at VSFG-mikroskopi kan løse kemisk specifik geometrisk information om individuelle selvmonterede ark ved at kombinere den med en neurale netværksfunktionsløser. Endelig diskuterer billederne opnået under brightfield-, SHG- og VSFG-konfigurationer af forskellige prøver kort de unikke oplysninger, der afsløres af VSFG-billeddannelse.
Vibrational sum-frequency generation (VSFG), en andenordens ikke-lineær optisk teknik1,2, er blevet anvendt i vid udstrækning som et spektroskopiværktøj til kemisk profilering af symmetri-tilladte prøver 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Traditionelt er VSFG blevet anvendt på grænsefladesystemer 8,9,10,11 (dvs. gas-væske, væske-væske, gas-fast, fast-væske), som mangler inversionssymmetri – et krav til VSFG-aktivitet. Denne anvendelse af VSFG har givet et væld af molekylære detaljer om nedgravede grænseflader 12,13, konfigurationer af vandmolekyler ved grænseflader 14,15,16,17,18 og kemiske arter ved grænseflader 19,20,21,22.
Selvom VSFG har været stærk til at bestemme molekylære arter og konfigurationer ved grænseflader, er dets potentiale til måling af molekylære strukturer af materialer, der mangler inversionscentre, ikke blevet opfyldt. Dette skyldes dels, at materialerne kunne være heterogene i deres kemiske miljø, sammensætninger og geometriske arrangement, og et traditionelt VSFG-spektrometer har et stort belysningsområde i størrelsesordenen 100 μm2. Således rapporterer traditionel VSFG-spektroskopi om ensemble-gennemsnitlig information af prøven over et typisk 100 μm2 belysningsområde. Dette ensemblegennemsnit kan føre til signalannulleringer mellem velordnede domæner med modsatte orienteringer og fejlkarakterisering af lokale heterogeniteter 15,20,23,24.
Med fremskridt inden for høj numerisk blænde (NA), reflekterende mikroskopmål (Schwarzschild og Cassegrain geometrier), som er næsten fri for kromatiske aberrationer, kan fokusstørrelsen af de to stråler i VSFG-eksperimenter reduceres fra 100 μm 2 til 1-2 μm2 og i nogle tilfælde submikron25. Inklusive dette teknologiske fremskridt har vores gruppe og andre udviklet VSFG til en mikroskopiplatform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. For nylig har vi implementeret et inverteret optisk layout og bredbåndsdetekteringsskema37, som muliggør en problemfri samling af multimodale billeder (VSFG, anden harmonisk generation (SHG) og brightfield optisk). Multimodalitetsbilleddannelsen muliggør hurtig inspektion af prøver ved hjælp af optisk billeddannelse, korrelering af forskellige typer billeder sammen og lokalisering af signalpositioner på prøvebillederne. Med den akromatiske belysningsoptik og valg af pulserende laserbelysningskilde giver denne optiske platform mulighed for fremtidig problemfri integration af yderligere teknikker såsom fluorescensmikroskopi38 og Ramanmikroskopi, blandt andre.
I dette nye arrangement er prøver som hierarkiske organisationer og en klasse af molekylære selvsamlinger (MSA’er) blevet undersøgt. Disse materialer omfatter kollagen og biomimetik, hvor både den kemiske sammensætning og geometriske organisation er vigtige for materialets ultimative funktion. Fordi VSFG er et andenordens ikke-lineært optisk signal, er det specifikt følsomt over for intermolekylære arrangementer39,40, såsom intermolekylær afstand eller vridningsvinkler, hvilket gør det til et ideelt værktøj til at afsløre både kemiske sammensætninger og molekylære arrangementer. Dette arbejde beskriver VSFG-, SHG- og brightfield-modaliteterne for kerneinstrumentet, der består af en ytterbiumdoteret hulrums-faststoflaser, der pumper en optisk parametrisk forstærker (OPA), et hjemmebygget multimodalt inverteret mikroskop og monokromatorfrekvensanalysator koblet til en todimensionel ladet koblet enhed (CCD) detektor27. En trinvis konstruktions- og justeringsprocedure og en komplet delliste over opsætningen leveres. En dybdegående analyse af en MSA, hvis grundlæggende molekylære underenhed består af et molekyle natrium-dodecylsulfat (SDS), et fælles overfladeaktivt middel og to molekyler β-cyclodextrin (β-CD), kendt som SDS@2 β-CD heri, gives også som et eksempel for at vise, hvordan VSFG kan afsløre molekylespecifikke geometriske detaljer om organiseret stof. Det er også blevet påvist, at kemikaliespecifikke geometriske detaljer i MSA kan bestemmes med en neurale netværksfunktionsløsertilgang.
De mest kritiske trin er fra 1, 42 til 1, 44. Det er afgørende at justere objektivobjektivet godt for en optisk rumlig opløsning. Det er også vigtigt at indsamle det udsendte signal, relæ og projicere scanningsstrålen som en linje ved indgangsspalterne. Korrekte justeringer ville garantere den bedste opløsning og signal-støj-forhold. For en typisk prøve, som SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm ark, vil et billede med god opløsning (~1 μm opløsning) med et højt signal-støj-forhold tage 20 minutter. Dette er allered…
The authors have nothing to disclose.
Instrumentudviklingen støttes af Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW og WX støttes af National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. BY støttes af Youth Innovation Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (CAS, 2021183).
1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB – N-BK7 | SFG signal collection |
Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |