Et multimodalt, raskt hyperspektralt bilderammeverk ble utviklet for å oppnå bredbånds vibrasjonell sumfrekvensgenerering (VSFG) bilder, sammen med brightfield, andre harmoniske generasjons (SHG) bildebehandlingsmodaliteter. På grunn av at den infrarøde frekvensen resonerer med molekylære vibrasjoner, avsløres mikroskopisk strukturell og mesoskopisk morfologikunnskap om symmetritillatte prøver.
Vibrasjonell sumfrekvensgenerering (VSFG), et andreordens ikke-lineært optisk signal, har tradisjonelt blitt brukt til å studere molekyler ved grensesnitt som en spektroskopiteknikk med en romlig oppløsning på ~ 100 μm. Spektroskopien er imidlertid ikke følsom for heterogeniteten til en prøve. For å studere mesoskopisk heterogene prøver, presset vi sammen med andre oppløsningsgrensen for VSFG-spektroskopi ned til ~ 1 μm nivå og konstruerte VSFG-mikroskopet. Denne bildebehandlingsteknikken kan ikke bare løse prøvemorfologier gjennom bildebehandling, men også registrere et bredbånds VSFG-spektrum på hver piksel av bildene. Å være en andreordens ikke-lineær optisk teknikk, muliggjør valgregelen visualisering av ikke-sentrosymmetriske eller kirale selvmonterte strukturer som ofte finnes i biologi, materialvitenskap og bioteknologi, blant andre. I denne artikkelen vil publikum bli guidet gjennom en invertert overføringsdesign som gjør det mulig å avbilde ufikserte prøver. Dette arbeidet viser også at VSFG-mikroskopi kan løse kjemisk-spesifikk geometrisk informasjon om individuelle selvmonterte ark ved å kombinere den med en nevral nettverksfunksjonsløser. Til slutt diskuterer bildene som er oppnådd under brightfield-, SHG- og VSFG-konfigurasjoner av forskjellige prøver, kort den unike informasjonen som ble avslørt av VSFG-bildebehandling.
Vibrasjonell sumfrekvensgenerering (VSFG), en andreordens ikke-lineær optisk teknikk1,2, har blitt brukt mye som et spektroskopiverktøy for å kjemisk profilere symmetritillatte prøver 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Tradisjonelt har VSFG blitt brukt på grenseflatesystemer 8,9,10,11 (dvs. gass-væske, væske-væske, gass-fast, fast-væske), som mangler inversjonssymmetri – et krav for VSFG-aktivitet. Denne anvendelsen av VSFG har gitt et vell av molekylære detaljer av nedgravde grensesnitt 12,13, konfigurasjoner av vannmolekyler ved grensesnitt 14,15,16,17,18 og kjemiske arter ved grensesnitt 19,20,21,22.
Selv om VSFG har vært kraftig i å bestemme molekylære arter og konfigurasjoner ved grensesnitt, har potensialet i å måle molekylære strukturer av materialer som mangler inversjonssentre ikke blitt oppfylt. Dette skyldes blant annet at materialene kan være heterogene i sitt kjemiske miljø, sammensetninger og geometriske arrangement, og et tradisjonelt VSFG-spektrometer har et stort belysningsområde i størrelsesorden 100 μm2. Dermed rapporterer tradisjonell VSFG-spektroskopi om ensemble-gjennomsnittlig informasjon om prøven over et typisk 100 μm2 belysningsområde. Dette ensemblegjennomsnittet kan føre til signalkanselleringer mellom velordnede domener med motsatt orientering og feilkarakterisering av lokale heterogeniteter 15,20,23,24.
Med fremskritt i høy numerisk blenderåpning (NA), reflekterende mikroskopmål (Schwarzschild og Cassegrain geometrier), som er nesten fri for kromatiske avvik, kan fokusstørrelsen på de to bjelkene i VSFG-eksperimenter reduseres fra 100 μm 2 til 1-2 μm2 og i noen tilfeller submikron25. Inkludert denne teknologiske utviklingen har vår gruppe og andre utviklet VSFG til en mikroskopiplattform 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Nylig har vi implementert et invertert optisk layout og bredbåndsdeteksjonsskjema37, som muliggjør en sømløs samling av multimodale bilder (VSFG, andre harmoniske generasjon (SHG) og brightfield optisk). Multimodalitetsavbildningen tillater rask inspeksjon av prøver ved hjelp av optisk bildebehandling, korrelerer ulike typer bilder sammen og lokaliserer signalposisjoner på prøvebildene. Med den akromatiske belysningsoptikken og valget av pulserende laserbelysningskilde, muliggjør denne optiske plattformen fremtidig sømløs integrering av tilleggsteknikker som fluorescensmikroskopi38 og Raman-mikroskopi, blant andre.
I dette nye arrangementet har prøver som hierarkiske organisasjoner og en klasse av molekylære selvsamlinger (MSA) blitt studert. Disse materialene inkluderer kollagen og biomimetikk, hvor både kjemisk sammensetning og geometrisk organisering er viktig for materialets endelige funksjon. Fordi VSFG er et andreordens ikke-lineært optisk signal, er det spesielt følsomt for intermolekylære arrangementer39,40, for eksempel intermolekylære avstands- eller vridningsvinkler, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å avsløre både kjemiske sammensetninger og molekylære arrangementer. Dette arbeidet beskriver VSFG-, SHG- og brightfield-modalitetene til kjerneinstrumentet som består av en ytterbium-dopet hulrom solid-state laser som pumper en optisk parametrisk forsterker (OPA), et hjemmebygd multimodalt invertert mikroskop og monokromatatorfrekvensanalysator koblet til en todimensjonal ladet koblet enhet (CCD) detektor27. En trinnvis konstruksjons- og justeringsprosedyrer, og en komplett deleliste over oppsettet, er gitt. En grundig analyse av en MSA, hvis grunnleggende molekylære underenhet består av ett molekyl natrium-dodecylsulfat (SDS), et vanlig overflateaktivt middel og to molekyler β-cyklodekstrin (β-CD), kjent som SDS@2 β-CD heri, er også gitt som et eksempel for å vise hvordan VSFG kan avsløre molekylspesifikke geometriske detaljer av organisert materie. Det har også blitt demonstrert at kjemisk-spesifikke geometriske detaljer av MSA kan bestemmes med en nevrale nettverksfunksjonsløser-tilnærming.
De mest kritiske trinnene er fra 1,42 til 1,44. Det er viktig å justere objektivlinsen godt for en optisk romlig oppløsning. Det er også viktig å samle det utsendte signalet, reléet og projisere skannestrålen som en linje ved inngangsspaltene. Riktig justering vil garantere den beste oppløsningen og signal-støy-forholdet. For en typisk prøve, som SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm ark, vil et bilde med god oppløsning (~1 μm oppløsning) med høyt signal-støy-forhold ta 20 minutter. Dette er allerede raskere enn de…
The authors have nothing to disclose.
Instrumentutviklingen er støttet av Grant NSF CHE-1828666. ZW, JCW og WX støttes av National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences, Grant 1R35GM138092-01. BY støttes av Youth Innovation Promotion Association, Chinese Academy of Sciences (CAS, 2021183).
1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB – N-BK7 | SFG signal collection |
Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |