Realtidsanalys av levande vävnad ger viktiga funktionella och mekanistiska data. Denna artikel beskriver protokollen och kritiska variabler för att säkerställa korrekt och reproducerbar generering av data av ett nytt och pumpfritt flerkanaligt fluidiksystem som underhåller och utvärderar ett brett spektrum av vävnads- och cellmodeller.
Många in vitro-modeller som används för att undersöka vävnadsfunktion och cellbiologi kräver ett flöde av media för att ge tillräcklig syresättning och optimala cellförhållanden som krävs för att upprätthålla funktion och viabilitet. För detta ändamål har vi utvecklat ett flerkanaligt flödesodlingssystem för att hålla vävnad och celler i odling och kontinuerligt bedöma funktion och viabilitet genom antingen in-line-sensorer och/eller insamling av utflödesfraktioner. Systemet kombinerar 8-kanals, kontinuerlig optisk avkänning av syreförbrukningshastigheten med en inbyggd fraktionsuppsamlare för att samtidigt mäta produktionshastigheten för metaboliter och hormonutsöndring. Även om den kan upprätthålla och bedöma ett brett spektrum av vävnads- och cellmodeller, inklusive öar, muskler och hypotalamus, beskriver vi här dess funktionsprinciper och de experimentella förberedelser/protokoll som vi har använt för att undersöka bioenergetisk reglering av isolerad musnäthinna, musretinalt pigmentepitel (RPE)-choroid-sclera och odlade humana RPE-celler. Innovationer i utformningen av systemet, såsom pumplöst vätskeflöde, har lett till en kraftigt förenklad drift av ett flerkanaligt flödessystem. Videor och bilder visas som illustrerar hur man monterar, förbereder instrumentet för ett experiment och laddar de olika vävnads-/cellmodellerna i perifusionskamrarna. Dessutom beskrivs och diskuteras riktlinjer för val av betingelser för protokoll- och vävnadsspecifika experiment, inklusive inställning av rätt förhållande mellan flöde och vävnad för att erhålla konsekventa och stabila odlingsförhållanden och noggranna bestämningar av konsumtions- och produktionshastigheter. Kombinationen av optimalt vävnadsunderhåll och realtidsbedömning av flera parametrar ger mycket informativa datamängder som kommer att ha stor nytta för forskning inom ögats fysiologi och läkemedelsutveckling för behandling av nedsatt syn.
Perifusionssystem har en lång historia inom livsvetenskaperna. I synnerhet för studier av öars sekretoriska funktion har de använts för att karakterisera kinetiken för insulinutsöndring som svar på sekretagoger1. Förutom att samla in utflödesfraktioner för efterföljande analys av hormoner och metaboliter har realtidssensorer införlivats, främst för detektion av syreförbrukning 2,3,4. Utbredda ansträngningar för att bättre förstå mekanismer som medierar sjukdomar i ögat har begränsats av en brist på fysiologiskt relevanta metoder för att bedöma metabolisk reglering och dysreglering av de olika isolerade komponenterna i ögat, inklusive näthinnan, retinal pigmentepitel (RPE)-choroid-sclera och odlade RPE-celler. Statiska system avsedda för odlade celler har anpassats för vävnad5, men vävnad kräver flöde för tillräcklig syresättning. Flödessystem har varit framgångsrika när det gäller att noggrant och reproducerbart mäta realtidssvar i syreförbrukningshastighet (OCR) av näthinnan och RPE-choroid-sclera, och vävnaderna förblir metaboliskt stabila i mer än 8 timmar, vilket möjliggör mycket informativa protokoll som involverar flera testföreningar 4,6,7,8,9 . Icke desto mindre har driften av fluidiksystem historiskt sett krävt en skräddarsydd apparat och utbildad teknisk personal i icke-standardiserade metoder. Sådana system har inte antagits som standardmetod i de flesta laboratorier. BaroFuse är ett nyutvecklat fluidiksystem som inte förlitar sig på pumpar, utan snarare på gastryck för att driva flödet genom flera kanaler och vävnadskammare (figur 1). Varje kanal övervakas kontinuerligt för OCR, och utflödet samlas upp med en plattbaserad fraktionsuppsamlare för efterföljande analys av innehållet. Det är viktigt att instrumentets vävnadsperifusionskamrar är utformade för att rymma vävnader av olika geometrier och storlekar.
Hjärtat i instrumentet är fluidiksystemet, där flödet drivs från en förseglad, trycksatt behållare genom små slangar med innerdiameter (ID) (vilket bidrar med det mest betydande flödesmotståndet i vätskekretsen) upp i glasvävnadskamrarna som rymmer vävnaden. Trycket till mediereservoarmodulen (MRM) tillförs av lågtrycks- och högtrycksregulatorer anslutna till en gasflaska som innehåller en blandning av gaser (vanligtvis 21 %O2, 5 % CO 2, balans N2), och behållaren förseglas uppifrån av perifusionskammarmodulen (PCM) som håller vävnadskammarenheterna (TCA). Flödeshastigheten styrs av längden och ID på motståndsrören och tryckinställningen för en lågtrycksregulator. Utflödesrör som är anslutna till toppen av vävnadskamrarna levererar vätska till antingen en avfallsbehållare (som vägs kontinuerligt för automatisk bestämning av flödeshastigheten) eller till brunnar på en 96-hålsplatta som styrs av fraktionsuppsamlaren. O2-detektionssystemet mäter livslängden för ettO2-känsligt färgämne målat på insidan av var och en av glasvävnadskamrarna nedströms vävnaden. Denna information används sedan för att kontinuerligt beräkna OCR. Hela fluidiksystemet finns i en temperaturkontrollerad kapsling och gastanken, fraktionsuppsamlaren och datorn är de viktigaste komponenterna i instrumentet (figur 2A). Slutligen tjänar programvara som kör instrumentet till att styra dess funktion (inklusive beredning och timing av injicerade testföreningar, flödesmätningssystem och fraktionsuppsamlartid), samt bearbetning och grafering av OCR-data och andra kompletterande mätningar.
I den här artikeln beskriver vi protokollen för att använda fluidiksystemet för att perifuse och bedöma OCR och laktatproduktionshastighet (LPR) för olika isolerade komponenter i ögat. LPR är en parameter som återspeglar glykolytisk hastighet som är mycket komplementär till OCR, där paret står för de två huvudgrenarna av energigenerering från kolhydrater i cellen10. Eftersom beredning av vävnaden och laddning av den i vävnadskamrarna bäst lärs genom att titta på proceduren, kommer videon att hjälpa till att illustrera flera av de kritiska stegen som utförs under installation och drift som inte lätt kan förmedlas med enbart text.
Beskrivningen av protokollet är uppdelad i 8 avsnitt som motsvarar olika faser i försöket (figur 2B): 1. Förberedelse före försöket. 2. Beredning/jämvikt av perifusatet. 3. Instrumentets uppbyggnad. 4. Jämvikt mellan vävnader. 5. Experimentellt protokoll. 6. Instrumentets haveri. 7. Behandling av uppgifter. och 8. analyser av utflödesfraktioner.
På grund av bioenergetikens betydelse för alla aspekter av cellfunktion och underhåll av olika komponenter i ögat finns det ett kritiskt behov av metoder för att studera dess reglering. I synnerhet är neural näthinna och RPE beroende av metabolism för både generering av energi samt intra- och intercellulär signalering14,15,16,17. På grund av deras höga oxidativa kapacitet är isolerade vävnader i ögat inte väl underhållna under statiska förhållanden18,19 och därför kräver studier av isolerade komponenter i ögat flödessystem som både kan upprätthålla och bedöma metaboliska processer. Fluidiksystemet utvecklades för att generera OCR- och LPR-data från ett brett spektrum av vävnadstyper och i denna artikel presenterade vi detaljerade protokoll som visade sig ge optimala resultat.
Den viktigaste faktorn för att generera robusta data med hjälp av flödessystemet inkluderar förjämvikt av CO2-baserade medier/buffert vid 39 °C (för att säkerställa att perifusat inte är övermättat med upplöst gas som skulle avgasas under experimentet). I synnerhet medier eller KRB-buffert som lagras vid 4 °C kommer att vara övermättade i förhållande till 37 °C och kommer att avgasas under experimentet om tiderna före jämvikt är otillräckliga. Dessutom får vävnad som laddas in i vävnadskamrarna inte traumatiseras av felaktig isolering av vävnad på grund av sönderrivning eller ofullständig separation av vävnad, eller genom att vävnad i låg mängd bikarbonatbaserad buffert exponeras för atmosfärisk luft under för lång tid. Temperaturkontrollen, flödesstabiliteten och tillförlitligheten för O2 -detektering har liten variabilitet och dessa faktorer bidrar inte nämnvärt till felfrekvensen.
Instrumentet har åtta flödeskanaler/vävnadskammare som löper samtidigt som förses med perifusat från två reservoarer, fyra vävnadskammare för varje reservoar. För att få de mest exakta tidsförloppen för OCR korrigeras kinetiska kurvor av baslinjekorrigerade av kammare som inte är belastade med vävnad. Således skulle ett typiskt experimentellt protokoll involvera två grupper av tre vävnadskammare. Protokoll kan i allmänhet delas in i två kategorier: den ena är de olika testföreningsprotokollen på varje sida (t.ex. läkemedel/vehikel på ena sidan av MRM och bara vehikel på den andra); Den andra är samma injektionsprotokoll för testsubstans på båda sidor av MRM, men olika vävnads- eller vävnadsmodell på varje sida av MRM. I denna artikel jämfördes effekterna av oligomycin och FCCP på näthinnan med OCR av vävnad som inte exponerades för några testföreningar, och två vävnader utvärderades samtidigt under samma protokoll och förhållanden för att identifiera vävnadsspecifikt beteende. Det senare illustrerades i denna studie genom att visa ökat dynamiskt omfång av ämnesomsättningen av RPE-choroid-sclera i förhållande till näthinnan parallellt i samma experiment. Andra rapporter har beskrivit ett bredare spektrum av studiedesigner, inklusive mätning av effekterna av varierandeO2-nivåer på OCR och LPR, och koncentrationsberoenden av bränslen, droger och toxiner20,21. Dessutom, även om vi har begränsat analysen av utflödesfraktioner till mätning av laktat och beräkning av LPR, ökar informationsinnehållet i ett experiment kraftigt om flera föreningar och klasser av föreningar i utflödesfraktionerna analyseras, såsom hormoner, neurotransmittorer, cellsignaler och metaboliter som kan lämna cellerna20,22, 23. veckor
Laddningen av isolerad näthinna eller RPE-choroid-sclera är okomplicerad, och när de väl har isolerats placeras dessa vävnader helt enkelt i toppen av vävnadskamrarna med pincett och får sjunka ner till frittan. RPE-celler odlade på filterinsatser utvecklar lämplig polarisering och markörer för RPE-mognad efter 4-8 veckor i odling. Det är inte möjligt att ta bort RPE för analys av levande celler när den väl är fäst vid transwell-membranet, om RPE-mognad och polarisering ska bibehållas24. Perifusionskammaren kan rymma remsor av transwell-membranet som skärs av med en skalpell medan de är nedsänkta i buffert och snabbt förs in i vävnadskamrarna. Även om skärning av filterremsor har placerats i ett statiskt system24, finns ingen annan fluidikmetod för att bedöma dessa viktiga celltyper tillgänglig. Responsen från RPE-cellerna var snabb och mer dynamisk än både näthinnan och RPE-choroid-sclera, sannolikt delvis på grund av omedelbar tillgång till både de apikala och basala aspekterna av RPE-cellerna konfigurerade som ett monolager på membraninsatsen.
En annan faktor för att säkerställa att data har den högsta signalen till brus är att välja det optimala förhållandet mellan vävnad som laddas in i perifusionskamrarna i förhållande till flödeshastigheten. För lite vävnad i förhållande till flödeshastigheten resulterar i en skillnad i upplöstO2-koncentration mellan inflöde och utflöde som är mycket liten och svår att mäta på ett tillförlitligt sätt. Däremot, om flödet är för långsamt, blir koncentrationen av O2 så låg att vävnaden påverkas av hypoxi. Ändå kan det gastrycksdrivna vätskeflödet bibehållas vid flödeshastigheter ner till 5 ml/min som endast kräver små mängder vävnad för noggranna OCR- och LPR-mätningar. I experimenten som visas här användes cirka 20 ml/min/kanal vilket var lämpligt för antingen en näthinna, två RPE-choroid-skleror eller 360 000 RPE-celler. För att minimera systemeffekterna som fördröjer och sprider vävnadens exponering för den injicerade testsubstansen, tillförs vävnadskamrarna i flera storlekar, så att mängden vävnad (och flödeshastigheten) matchas med lämplig storlek på kammaren.
Data från analyserna som visas i denna artikel representerades på två sätt: absolut magnitud med avseende på hastighet, eller fraktionella förändringar i förhållande till ett stabilt tillstånd eller baslinje. Fokus låg på illustration av mätning av respons på testsubstanser. Fluidiksystemet är dock väl lämpat för att bedöma och jämföra effekter av vävnadsbehandling före perifusionsanalysen, t.ex. genetiska modifieringar. Att testa om en behandling skiljer sig från kontroll är mest robust om effekterna av behandlingen på normaliserade svar av testsubstanser analyseras. Om analysen kräver absoluta magnituder maximeras den statistiska styrkan i analyserna av prover som förbehandlas om deras bedömning och kontroller utförs i samma perifusionsexperiment.
Förutom omröraren levereras alla delar som kommer i kontakt med vätska av tillverkaren som förbrukningsvaror och har steriliserats. Dessa delar bör inte återanvändas, eftersom experiment ibland kommer att gå förlorade på grund av ofullständig rengöring och förorenade ytor. Systemet i början av installationen är sterilt. Media tillsätts dock till MRM och vävnad laddas i kamrarna under icke-sterila förhållanden. Vi har mätt OCR i systemet som är sammansatt med delar som är sterila, men där själva experimentet utförs under icke-sterila förhållanden. Det tar cirka 14 timmar för bakterier att ackumuleras till den grad att de har mätbara OCR (opublicerade resultat). Om protokoll används som är mindre än 10 timmar eller så, kommer ackumulering av bakterier och eventuella effekter på grund av dessa att vara försumbara.
Många forskare använder instrument som är utformade för att mäta OCR under statisk inkubation av ett monolager av celler med en relativt hög genomströmning25,26. Däremot upprätthåller fluidikinstrumentet som vi har testat och beskrivit i denna artikel vävnad genom att säkerställa adekvatO2-leverans, vilket är avgörande för de större diffusionsavstånden som finns i vävnadsprover. Dessutom kan den samla in fraktioner som möjliggör bedömning av flera parametrar parallellt med OCR, vilket avsevärt förbättrar möjligheten att studera relationer mellan dem. Slutligen kan koncentrationer av lösta gaser (t.ex.O2 och CO 2 kontrolleras, vilket ökar varaktigheten av experiment med bikarbonatbaserade medier och buffert, vilket gör det möjligt för användaren att studera effekterna av O2 . Det bör påpekas att en begränsning för båda metoderna är oförmågan att studera urlakningen av testföreningar, en funktion som andra perifusionssystem har 4,27,28. En annan faktor att ta hänsyn till vid bestämning av den optimala analysmodaliteten är det faktum att fluidiksystem använder mer media och testföreningar än statiska system. Den extra kostnaden minimeras dock med de nuvarande fluidiksystemen på grund av de låga flödeshastigheterna som systemet kan användas.
Sammantaget beskrivs en detaljerad beskrivning av protokollen för att utföra experiment med ett nytt flödes-/bedömningsinstrument. Data som genererats med näthinnan och RPE-choroid-sclera rekapitulerade tidigare resultat som erhållits med system som är mycket svårare att använda (och inte lättillgängliga). Det visades också att systemet kan underhålla och bedöma RPE-celler fästa vid transwell-membran, en mycket viktig cellulär modell som inte tidigare har analyserats med flödessystem på grund av cellernas bräcklighet. Huvuddelarna av protokollet består av en 75 minuters ställtid, följt av en 90 minuters jämviktsperiod och det experimentella protokollet som gör det lämpligt för rutinmässig användning av laboratorier som inte är specialiserade på drift av fluidiksystem. Även om vi fokuserade på att mäta vävnadens akuta respons på testsubstanser, är systemet mycket lämpligt för att jämföra vävnad från olika källor, t.ex. djurmodeller eller cellmodeller som har förändrats genetiskt eller genomgått testbehandlingar/tillstånd. Dessutom är omfattningen av analyser som kan utföras på utflödesfraktionerna omfattande och inkluderar metaboliter, cellsignalmolekyler och utsöndrade hormoner/neurotransmittorer samt flerkomponentsanalys genererad av masspektrometri på fraktionerna såväl som vävnaden.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen finansierades av anslag från National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) och R01 EY006641, R01 EY017863 och R21 EY032597 (J.B.H.).
BIOLOGICAL SAMPLES | |||
C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
REAGENTS | |||
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
SUPPLIES | |||
Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
COMMERCIAL ASSAYS | |||
Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
EQUIPMENT | |||
BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |