Her præsenterer vi en metode til standardisering af blodpladeagonisten kollagen-relateret peptid tværbundet (CRP-XL) ved hjælp af lystransmission aggregometri. Mens protokollen er rettet mod blodpladefunktion, kan den eksperimentelle proces anvendes på de fleste biologiske molekyler og bioassays for at sikre videnskabelig stringens og reproducerbarhed.
Metrologi – målevidenskaben – er et emne, som kun få biologiske forskere undervises i i deres uddannelse til skade for dem; Anvendelsen af enkle standardiseringsprocesser i den daglige arbejdspraksis giver tillid til data og reproducerbarhed over afstand og tid.
Denne metode demonstrerer, hvordan man standardiserer et kernelaboratorieeksperiment, der anvendes bredt i hæmostaseforskning og klinisk praksis, specifikt måling af responser på blodpladekollagenreceptoren (glycoprotein [GP] VI) agonistkollagenrelateret peptid, tværbundet (CRP-XL) ved lystransmissionsaggregometri (LTA). Brug af denne tilgang vil sikre intra-lab reproducerbarhed og inter-lab harmonisering, uanset agonistlager eller leverandør. Det er vigtigt, at denne metode gælder for andre blodpladeagonister og faktisk mange andre biologiske molekyler og bioassays.
Processen beskrevet nedenfor involverer at lave en 6-8-punkts fortyndingsserie af ‘standarden’ og ‘testen’ (det materiale, du kontrollerer) og køre dem side om side i et valgt assay (i dette tilfælde LTA). CRP-XL anvendes ved masse/volumenkoncentrationer, men ikke alle materialer giver den samme biologiske aktivitet ved en given koncentration, så der laves en fortyndingsserie for at sammenligne standard- og testmaterialet og bestemme, hvilken koncentration der er nødvendig for at give tilsvarende aktivitet. Fortyndingsserien skal spænde over 0-100% aggregering. Data afbildes ved hjælp af ikke-lineær regression, og EC50-værdien for hver prøve (standard og test) bestemmes. For at tildele aktivitet divideres standardens EC50-værdi med testens værdi for at bestemme, hvor meget mere eller mindre potent den er, og juster koncentrationen i overensstemmelse hermed. Denne fremgangsmåde vil sikre, at den samme biologiske “aktivitet” føjes til analysen igen og igen.
Mange af os bruger biologiske agonister og antagonister i vores eksperimenter, oftest i et biologisk assay, der kvantificerer deres virkning på cellefunktionen under specifikke forhold. Metoden beskrevet her er for blodpladeagonisten kollagenrelateret peptid, tværbundet (CRP-XL), en glycoprotein VI-agonist, der aktiverer blodplader, og hvis aktivitet kan måles i en række forskellige assays (lystransmissionsaggregometri, mikroskopi, flowcytometri, Ca2+ frigivelse osv.), Men agoniststandardiseringsprotokollen gælder for enhver biologisk agonist / antagonist og / eller bioassay. De fysiske videnskaber er velbevandrede i brugen af standarder i deres daglige arbejdspraksis, og virksomheder, der udvikler bioterapeutiske lægemidler i den kommercielle sektor, forstår værdien af at bruge referencestandarder1, men de forbliver underudnyttet af mange biologiske forskere, især i det akademiske forskningssamfund, og deres manglende anvendelse påvirker kvaliteten af det videnskabelige output negativt.
CRP-XL er en specifik GPVI-specifik agonist, som blodpladefeltet har brugt i årtier siden beskrivelsen i 19952, hvilket hjælper samfundet med at afgrænse GPVI’s rolle fra andre kollagenbindende blodpladeproteiner lige siden 3,4. Denne agonist kan købes fra en række kommercielle kilder eller produceres internt. Peptidmonomeren kan købes hos en leverandør og derefter tværbindes internt, eller dette kan gøres af leverandøren mod et ekstra gebyr. Yderligere omkostningsbesparelser kan opnås ved at reducere den krævede renhed ved levering (f.eks. 70% versus 95%). Der er heller ingen konsensus om, hvordan CRP-XL skal opbevares, idet nogle vælger kryoopbevaring og andre køling, nogle holder materialet frysetørret indtil brug, og andre opbevarer det i opløsning (vand eller buffer, afhængigt af præference). Derfor er kvaliteten og sammensætningen af laboratorielagre ikke-standardiserede eller harmoniserede. Da denne agonist anvendes i en defineret koncentration (masse/volumen) snarere end aktivitetsenheder, vil styrken af CRP-XL i et laboratorium, f.eks. ved 1 μg/ml, ikke være den samme som i et andet. Det er værd at bemærke, at andre trombocytagonister, der anvendes i marken, allerede er standardiserede (f.eks. Trombin, som leveres og anvendes i aktivitetsenheder snarere end masse / volumen), så bevægelsen væk fra masse / volumen til biologiske enheder bør ikke være for udfordrende for samfundet. Det skal også bemærkes, at patienternes respons på trombocytagonister, herunder CRP-XL, varierer med hensyn til deres følsomhed over for agonister samt deres evne til at respondere (omfang af respons)5, så det er endnu vigtigere at anvende konsisterede mængder agonistaktivitet i analyserne.
Hvis trombocytagonister kan harmoniseres ved at bruge dem ved en defineret aktivitet i stedet for vægt / volumen, kan det sikres, at et eksperiment i et laboratorium er direkte sammenligneligt med det i andre laboratorier og kan reproduceres nøjagtigt med tillid. Indtil feltet når til enighed om, hvordan CRP-XL-aktivitet skal opbevares og standardiseres, er det vigtigt at udføre regelmæssig kontrol af materialet for at sikre dets konsistens i de måneder/år, hvor det anvendes.
Aktivitetsværditildeling for biologiske standarder skal ske gennem samarbejdende, multicenterstudier (for eksempel 6,7) og kræver specialekspertise. Behovet for etablerede biologiske standarder for trombocytagonister er for nylig blevet fremhævet af en samarbejdsundersøgelse8 støttet af International Society for Thrombosis and Haemostasis (ISTH); Indtil en international CRP-XL-standard er tilgængelig, kan forskere standardisere deres eget materiale lokalt for at sikre konsistens over tid, og at nyt materiale, der stammer kommercielt eller internt, er af sammenlignelig aktivitet med tidligere præparater såvel som resten af samfundet.
Som vist her er processen med standardisering af materialerne meget ligetil. Selvom det kræver lidt tid at evaluere nye batcher af materiale og/eller kontrollere, at den aktuelle batch er stabil og ikke mister aktivitet over tid, er belønningen, at eksperimenter er reproducerbare igen og igen og sammenlignelige over år snarere end blot levetiden for et parti reagens. Det betyder også, at andre forskere præcist kan genskabe analyseforholdene, og at samfundet er harmoniseret på globalt plan. Kritiske trin i protokollen omfatter fuldblodstapning og PRP-præparation9 samt præcision ved fremstilling af fortyndingsserien. Det er også vigtigt at sikre, at test- og standardkurverne er parallelle, før du fortsætter med EC50-sammenligningen . Hvis linjerne ikke er parallelle, eller asymptoterne ikke er ækvivalente, kan det indikere, at test- og standardmaterialet til en vis grad er forskellige.
Alle, der arbejder inden for de biologiske videnskaber, ved, at biologiske analyser ikke altid fungerer konsekvent, så man skal være opmærksom på dette, når man vurderer dataene. I eksemplet vist her, selvom vi bruger de samme donorer til at måle styrken af to meget ens, hvis ikke identiske, materialer, er bakkeskråningerne og asymptoterne ikke identiske. Alligevel accepterer vi en vis variabilitet og konkluderer, at kurverne i dette tilfælde er parallelle og derfor egnede til sammenligning og justering af styrke. Biologiske molekyler er store og komplekse, og posttranslationelle modifikationer under fremstillingen kan påvirke deres styrke i bioassays. Standardisering af biomolekyler og bioassays kan ikke udføres ved hjælp af masse eller volumen og skal gøres ved at kvantificere og sammenligne biologisk aktivitet i et bioassay11. Man skal bruge sin uddannelse og erfaring til at evaluere dataene i forbindelse med analysen.
Begrænsninger ved teknikken er, at selvom dataene kan indikere et problem med reagenset (e), kan de ikke fortælle dig, hvad problemet er. Yderligere arbejde vil være nødvendigt for at afgøre, hvorfor materialerne ikke er sammenlignelige. I en ideel verden ville ethvert materiale, der er kritisk for eksperiment(er) og efterfølgende videnskabelige konklusioner, blive verificeret ved massespektroskopi, men dette er ikke altid en mulighed. Hvis dataene imidlertid ikke er sammenlignelige, er yderligere undersøgelser stadig berettigede i en vis kapacitet. En anden begrænsning af denne tilgang er den tid og de ressourcer, der er nødvendige for at gøre det. Ideelt set bør testen og standarden sammenlignes hos 3-6 donorer for at give en vis tillid til at tildele materialet biologisk aktivitet, men vi føler, at dette er berettiget ved at understøtte reproducerbarhed og pålidelighed. Standardisering af biologisk materiale er ikke nødvendig, hver gang eksperimenter udføres, men som minimum bør det gøres for hvert nyt parti agonister, helst hyppigere, afhængigt af stabilitet og anvendelse. Hvis en standard stilles til rådighed, er dette noget, som internationale standardiseringsorganisationer kan skabe klarhed over.
Mens eksemplet her er for CRP-XL i forbindelse med måling af blodpladeaggregering, er protokollen til sammenligning af biomolekylers biologiske aktivitet i bioassays bredt anvendelig i hele sektoren.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
4% sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | Anticoagulant dissolved in water9 |
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | 54457 | |
CRP-XL | Peptide Protein Research Ltd. | A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd. | |
Cuvettes and stir bars | Stago | 86921 | Consumables for aggregometer |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M4880 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Sigma-Aldrich | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Prism | Graphpad | Analysis software package | |
Platelet rich plasma | Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8. |