अस्थि मज्जा संवहनी आला का एक इन विट्रो मॉडल प्री-कास्ट 3 डी पीईजी हाइड्रोगेल पर मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं को सीडिंग करके स्थापित किया गया है। एंडोथेलियल नेटवर्क, ईसीएम घटक, और आला की एएलपी गतिविधि उपयोग किए गए विकास कारक के आधार पर भिन्न होती है। मंच का उपयोग उन्नत कैंसर मॉडल के लिए किया जा सकता है।
अस्थि और अस्थि मज्जा अत्यधिक संवहनी और संरचनात्मक रूप से जटिल अंग हैं, और कैंसर और मेटास्टेसिस गठन के लिए साइटें हैं। इन विट्रो मॉडल हड्डी और अस्थि मज्जा-विशिष्ट कार्यों को पुन: परिभाषित करते हैं, जिसमें वैस्कुलराइजेशन भी शामिल है, जो ड्रग स्क्रीनिंग के साथ संगत हैं, अत्यधिक वांछनीय हैं। इस तरह के मॉडल इन विट्रो मॉडल में सरलीकृत, संरचनात्मक रूप से अप्रासंगिक दो-आयामी (2 डी) और विवो मॉडल में अधिक महंगे, नैतिक रूप से चुनौतीपूर्ण के बीच की खाई को पाट सकते हैं। यह लेख संवहनी, ओस्टोजेनिक अस्थि-मज्जा आला की पीढ़ी के लिए इंजीनियर पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) (पीईजी) मैट्रिसेस के आधार पर एक नियंत्रणीय त्रि-आयामी (3 डी) सह-संस्कृति परख का वर्णन करता है। पीईजी मैट्रिक्स डिजाइन एक सरल सेल सीडिंग चरण के माध्यम से 3 डी सेल संस्कृतियों के विकास की अनुमति देता है जिसमें कोई एनकैप्सुलेशन की आवश्यकता नहीं होती है, इस प्रकार जटिल सह-संस्कृति प्रणालियों के विकास को सक्षम किया जाता है। इसके अलावा, मैट्रिसेस पारदर्शी हैं और ग्लास-बॉटम 96-वेल इमेजिंग प्लेटों पर पूर्व-कास्ट हैं, जिससे सिस्टम माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त है। यहां वर्णित परख के लिए, मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एचबीएम-एमएससी) को पहले सुसंस्कृत किया जाता है जब तक कि पर्याप्त रूप से विकसित 3 डी सेल नेटवर्क नहीं बनता है। इसके बाद, जीएफपी-व्यक्त मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) को जोड़ा जाता है। संस्कृति विकास के बाद उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी होती है। एचबीएम-एमएससी नेटवर्क की उपस्थिति संवहनी जैसी संरचनाओं के गठन का समर्थन करती है जो अन्यथा नहीं बनती हैं और जो कम से कम 7 दिनों तक स्थिर रहती हैं। संवहनी जैसे नेटवर्क गठन की सीमा को आसानी से निर्धारित किया जा सकता है। इस मॉडल को अस्थि मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 2 (बीएमपी -2) के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करके एक ओस्टोजेनिक अस्थि-मज्जा आला की ओर ट्यून किया जा सकता है, जो एचबीएम-एमएससी के ओस्टोजेनिक भेदभाव को बढ़ावा देता है, जैसा कि सह-संस्कृति के दिन 4 और दिन 7 में क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) गतिविधि में वृद्धि द्वारा मूल्यांकन किया गया है। इस सेलुलर मॉडल का उपयोग विभिन्न कैंसर कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है और अध्ययन किया जा सकता है कि वे अस्थि- और अस्थि मज्जा-विशिष्ट संवहनी niches के साथ कैसे बातचीत करते हैं। इसके अलावा, यह स्वचालन और उच्च-सामग्री विश्लेषण के लिए उपयुक्त है, जिसका अर्थ है कि यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संस्कृति स्थितियों के तहत कैंसर की दवा स्क्रीनिंग को सक्षम करेगा।
अस्थि और अस्थि मज्जा संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से जटिल अंग हैं जो मानव स्वास्थ्य के लिए केंद्रीय हैं। यह अलग-अलग niches के अस्तित्व से परिलक्षित होता है जो हेमटोपोइजिस और हड्डी के रखरखावको नियंत्रित करते हैं1. अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि स्वस्थ अस्थि मज्जा में, हेमटोपोइएटिक और कंकाल स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव और विस्तार, साथ ही साथ उनकी संतान, अलग-अलग niches द्वारा नियंत्रित होती है। इन niches में विभिन्न सेल प्रकार शामिल हैं, जिनमें ओस्टियोवंशावली कोशिकाएं, मेसेनकाइमल स्टेम सेल, एंडोथेलियल और पेरिवास्कुलर कोशिकाएं, न्यूरोनल और ग्लियल कोशिकाएं, एडिपोसाइट्स, ओस्टियोक्लास्ट, मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल2 शामिल हैं। आश्चर्य की बात नहीं, ये ज्यादातर वाहिका से जुड़े niches विभिन्न प्रकार के ल्यूकेमिया3 के विकास में भी शामिल हैं और विभिन्न कैंसर 4 के लिए मेटास्टेसिस की साइटहैं। हड्डी के गठन, रीमॉडेलिंग और अस्थि (मज्जा) रखरखाव में इसकी विशिष्ट भूमिकाओं के कारण, हड्डी से जुड़े वाहिका में शरीर में कहीं और पाए जाने वाले वाहिका 5,6,7 से अलग विशिष्ट संरचनाएं होती हैं। इस प्रकार, एंटी-एंजियोजेनिक या वास्कुलचर-मॉड्यूलेटिंग दवाओं को व्यवस्थित रूप से लागू किया जाता है, इन विशेष वातावरणोंके भीतर अलग-अलग प्रभाव हो सकते हैं। इसलिए, अस्थि और अस्थि मज्जा शारीरिक गुणों, हड्डी और अस्थि मज्जा पुनर्जनन, और चिकित्सीय उपचार के लिए प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए मॉडल अत्यधिक वांछनीय हैं।
शास्त्रीय द्वि-आयामी (2 डी) ऊतक संस्कृतियों और पशु मॉडल का उपयोग करके विवो जांच में हड्डी और अस्थि मज्जा 9,10 के विकास में शामिल विभिन्न कोशिकाओं और आणविक खिलाड़ियों की भूमिकाओं में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। मॉडल जो प्रासंगिक मानव कोशिकाओं के साथ उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों की अनुमति देते हैं, इन अत्यधिक जटिल प्रणालियों में चयनित मापदंडों को संशोधित करने के तरीके की हमारी समझ में सुधार कर सकते हैं।
पिछले दशक में, ऊतक इंजीनियरिंग से प्राप्त सिद्धांतों को 3 डी ऊतक मॉडल11,12 उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया है। ये ज्यादातर 3 डी मोनो- यासह-संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए बायोमैटेरियल्स में ऊतक-प्रासंगिक कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन पर निर्भर हैं। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स में फाइब्रिन 14, कोलेजन 15, और मैट्रिगेल16,17 हैं, जिनमें से सभी अत्यधिक जैव-संगत हैं और कई सेल प्रकारों के विकास के लिए उपयुक्त स्थिति प्रदान करते हैं। इन बायोमटेरियल्स में इन विट्रो मॉडल उत्पन्न करने की क्षमता है जो विवो18 में पाए जाने वाले विभिन्न संवहनी niches के प्रमुख पहलुओं को पुन: उत्पन्न करते हैं। इसके अलावा, संक्रमित संवहनी हड्डी और अस्थि मज्जा मॉडल उत्पन्न करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपयोग ने उच्च जटिलता 19,20,21,22 के इन विट्रो मॉडल की पीढ़ी में योगदान दिया है।
स्वाभाविक रूप से होने वाले बायोमैटेरियल्स के गुणों की संरचना और इंजीनियरिंग को नियंत्रित करने में कठिनाई ने सिंथेटिक एनालॉग्स के विकास को प्रेरित किया है जिन्हें तर्कसंगत रूप से अनुमानित भौतिक, रासायनिक औरजैविक गुणों के साथ डिजाइन किया जा सकता है। हमने पूरी तरह से सिंथेटिक फैक्टर XIII (FXIII) क्रॉस-लिंक्ड पॉली (एथिलीन ग्लाइकॉल) (पीईजी) आधारित हाइड्रोगेल विकसित किए हैं, जो सेल अटैचमेंट और रीमॉडेलिंग25,26 की सुविधा के लिए आरजीडी पेप्टाइड्स और मैट्रिक्स मेटालोप्रोटीज (एमएमपी) क्लीवेज साइटों के साथ कार्यात्मक हैं। इन बायोमैटेरियल्स के मॉड्यूलर डिजाइन का उपयोग सफलतापूर्वक 3 डी संवहनी हड्डी और अस्थि मज्जा मॉडल27,28 के गठन के लिए स्थितियों को अनुकूलित करने के लिए किया गया है।
विभिन्न संस्कृति स्थितियों और नए चिकित्सीय की बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए, उच्च थ्रूपुट क्षमता वाले मॉडल की आवश्यकता होती है। हमने हाल ही में दिखाया है कि हमारे पीईजी हाइड्रोगेल के एफएक्सIII क्रॉस-लिंकिंग को एक इलेक्ट्रोकेमिकल प्रक्रिया के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है जैसे कि एक गहन हाइड्रोगेल कठोरताढाल का गठन होता है। जब कोशिकाओं को ऐसे हाइड्रोगेल के शीर्ष पर जोड़ा जाता है, तो वे इंटीरियर की ओर पलायन करते हैं और धीरे-धीरे अत्यधिक परस्पर जुड़े 3 डी सेलुलर नेटवर्क30 में विकसित होते हैं। हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को समाहित करने की आवश्यकता का उन्मूलन, जो आमतौर पर अन्य 3 डी मचानों के साथ मौजूद होता है, न केवल प्रयोगात्मक डिजाइन को सरल बनाता है, बल्कि जटिल सह-संस्कृति प्रणालियों को उत्पन्न करने के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर विभिन्न सेल प्रकारों के अनुक्रमिक जोड़ की भी अनुमति देता है। ये हाइड्रोजेल ग्लास-बॉटम 96-वेल इमेजिंग प्लेटों पर प्री-कास्ट उपलब्ध हैं, इस प्रकार मैनुअल के साथ-साथ स्वचालित सेल सीडिंग प्रोटोकॉल द्वारा 3 डी संस्कृतियों की स्थापना प्राप्त की जा सकती है। पीईजी हाइड्रोगेल की ऑप्टिकल पारदर्शिता मंच को माइक्रोस्कोपी के साथ संगत बनाती है।
यहां, हम इस तैयार-से-उपयोग, सिंथेटिक प्लग-एंड-प्ले प्लेटफॉर्म के भीतर संवहनी ओस्टोजेनिक niches की पीढ़ी और लक्षण वर्णन के लिए एक सीधी विधि प्रस्तुत करते हैं। हम दिखाते हैं कि संवहनी नेटवर्क के विकास को आमतौर पर इन विट्रो ओस्टियोजेनेसिस, बोन मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन -2 (बीएमपी -2) को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विकास कारक के साथ उत्तेजित किया जा सकता है, जबकि ओस्टोजेनिक भेदभाव को फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक 2 (एफजीएफ -2) 27,31 के पूरक द्वारा रोका जा सकता है। समग्र उपस्थिति, साथ ही सेल और ईसीएम वितरण के संदर्भ में एफजीएफ -2-उत्तेजित नेटवर्क की तुलना में गठित नेटवर्क अलग हैं। इसके अलावा, हमने मार्कर के रूप में क्षारीय फॉस्फेट का उपयोग करके ओस्टोजेनिक प्रेरण की निगरानी की। हम समय के साथ इस मार्कर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करते हैं और गुणात्मक और मात्रात्मक तरीकों का उपयोग करके एफजीएफ -2 उत्तेजित नेटवर्क में अभिव्यक्ति की तुलना करते हैं। अंत में, हम दो संभावित अनुप्रयोगों के लिए इस मॉडल के उत्पन्न niches की उपयुक्तता प्रदर्शित करते हैं। सबसे पहले, हमने पूर्व-गठित niches में Bevacizumab जोड़कर और इसकी उपस्थिति में संवहनी नेटवर्क के क्षरण की निगरानी करके एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट दवा संवेदनशीलता परख का प्रदर्शन किया। दूसरे, हमने एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर और यू 2 ओएस ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को पूर्व-गठित ओस्टोजेनिक niches में जोड़ा, यह दिखाते हुए कि niches का उपयोग कैंसर कोशिकाओं और उनके पर्यावरण के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
यहां, हम पूरी तरह से सिंथेटिक और नियंत्रणीय 3 डी पीईजी-आधारित मैट्रिक्स में अत्यधिक संवहनी हड्डी और अस्थि मज्जा आला के इन विट्रो मॉडल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसमें अस्थि और अस्थि मज्जा जीव विज्ञान अनुसंधान, ऊतक इंजीनियरिंग और कैंसर अनुसंधान में विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोग हैं। यह मॉडल एक सिंथेटिक पीईजी-आधारित हाइड्रोगेल पर बनाता है जो आरजीडी पेप्टाइड्स और एमएमपी क्लीवेज साइटों के साथ कार्यात्मक है और ग्लास-बॉटम 96-वेल इमेजिंग प्लेटों30 पर गहराई से घनत्व ढाल के साथ डाला गया है। इस प्लग-एंड-प्ले प्लेटफॉर्म को हाइड्रोगेल में कोशिकाओं को समाहित करने की आवश्यकता के बिना अत्यधिक परस्पर जुड़े 3 डी सेलुलर नेटवर्क की स्थापना की अनुमति देने के लिए दिखाया गया था। पहले वर्णित सेल एनकैप्सुलेशन प्रोटोकॉल के समान, इस काम में, हम सेल प्रकार-विशिष्ट माइक्रोएन्वायरमेंट बनाने के लिए सेल-अंतर्निहित ईसीएम28 द्वारा सब्सट्रेट के रीमॉडेलिंग को दिखाते हैं। इस प्रकार, इस विधि के साथ, दवा स्क्रीनिंग परख और उच्च-सामग्री विश्लेषण आसानी से अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, ऑर्गेनोटाइपिक 3 डी संस्कृति स्थितियों के तहत किया जा सकता है। ग्लास-बॉटम 96-वेल प्लेट्स और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी हाइड्रोगेल प्लेटफॉर्म को तरल हैंडलिंग स्वचालन और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी के साथ संगत करते हैं।
ओस्टोजेनिक संवहनी अस्थि मज्जा आला उत्पन्न करने में पहला कदम कम से कम 3 दिनों के लिए पीईजी हाइड्रोगेल पर एचबीएम-एमएससी की पूर्व-संस्कृति है। इस समय के दौरान, वे हाइड्रोजेल से जुड़ते हैं, इसे भेदते हैं, और सेल-सेल संपर्क और ईसीएम जमाव स्थापित करना शुरू करते हैं। एचबीएम-एमएससी को सीडिंग करने से पहले, स्टोरेज बफर को हटा दिया जाना चाहिए। चूंकि हाइड्रोगेल 96-वेल इमेजिंग प्लेट के मानक कुएं के भीतर एक आंतरिक कुएं के अंदर स्थित है, इसलिए कुएं के किनारे आकांक्षा टिप डालना सुरक्षित है जब तक कि यह आंतरिक कुएं की अंगूठी को नहीं छूता है। एक वैक्यूम पंप का उपयोग आकांक्षा के लिए किया जा सकता है यदि इसे सबसे कम संभव चूषण बल पर सेट किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, आंतरिक वेल रिंग से कम से कम 0.8 मिमी ऊपर समायोजित नोजल ऊंचाई के साथ एक स्वचालित प्लेट वॉशर का उपयोग हाइड्रोगेल प्लेट से बफर को एस्पिरेट करने के लिए किया जा सकता है। तरल हैंडलिंग के लिए स्वचालन का उपयोग हाइड्रोगेल सतह को नुकसान को कम कर सकता है और परिणामस्वरूप संस्कृतियों की उच्च प्रजनन क्षमता का कारण बन सकता है। हाइड्रोजेल की सतह पर छोटे दोष दिखाई देते हैं जब कोशिकाएं हाइड्रोजेल पर बस जाती हैं और दोषपूर्ण हाइड्रोगेल क्षेत्रों में कम फोकस प्लेन पर दिखाई देती हैं। इसलिए, दिन 0 पर संदर्भ छवियों को प्राप्त करना सेल सीडिंग समरूपता और हाइड्रोगेल सतह अखंडता के लिए एक अच्छी गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। जबकि छोटे हाइड्रोगेल सतह दोष कुएं के आगे के उपयोग को नहीं रोकते हैं, कोशिकाएं दोषपूर्ण क्षेत्रों पर क्लस्टर करती हैं और गैर-प्रतिनिधि पैटर्न में बढ़ सकती हैं या अधिक तेज़ी से नीचे के ग्लास तक पहुंच सकती हैं, जहां वे एक मोनोलेयर में विकसित होती हैं। इन कुओं का उपयोग / मूल्यांकन करते समय इन कलाकृतियों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। परख की पूरी अवधि के दौरान किए गए किसी भी माध्यम परिवर्तन के लिए समान विचार लागू होते हैं।
प्रोटोकॉल के दूसरे चरण में जीएफपी-एचयूवीईसी को पूर्व-गठित एचबीएम-एमएससी मोनोकल्चर (सह-संस्कृति का दिन 0) में जोड़ना शामिल है। एचबीएम-एमएससी द्वारा जमा ईसीएम एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकास के लिए एक महान मचान प्रदान करता है, जो इस काम में, एचबीएम-एमएससी-वातानुकूलित माध्यम की उपस्थिति में भी, केवल हाइड्रोगेल पर गोल सेल क्लस्टर बना सकता है (दिखाया नहीं गया है)। एचबीएम-एमएससी संस्कृतियों पर बीज बोने पर, एचयूवीईसी माइक्रोवाइल जैसी संरचनाओं को एकीकृत करते हैं और सेल एनकैप्सुलेशन27,28 द्वारा उत्पन्न सह-संस्कृतियों में देखे गए संरचनाओं की तुलना में बनाते हैं। आमतौर पर, अच्छी तरह से विकसित 3 डी माइक्रोवस्कुलर-जैसे नेटवर्क सह-संस्कृति के 4 दिनों के भीतर बनते हैं, और इसे जीएफपी-लेबल एचयूवीईसी के उपयोग से अनुदैर्ध्य रूप से निगरानी की जा सकती है। इन संरचनाओं को संस्कृति में कम से कम 7 दिनों तक बनाए रखा जा सकता है, जिसका अर्थ है कि उपचार के जवाब में संवहनी नेटवर्क संगठन में परिवर्तन का पालन करने के लिए पर्याप्त समय है, जैसे कि एंटी-एंजियोजेनिक दवाओं की स्क्रीनिंग के लिए। एंडोथेलियल नेटवर्क के रूपात्मक तत्वों को अच्छी तरह से स्थापित उपकरणों का उपयोग करके जीएफपी छवियों को विभाजित करके बैच मोड में परिमाणित किया जा सकता है, जैसे कि इमेजजे33 के एंजियोजेनेसिस विश्लेषक प्लगइन, और उनके मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, दवा प्रभावकारिता और फार्माकोडायनामिक्स।
कई संभावित अनुप्रयोगों के लिए वर्णित सेलुलर मॉडल का एक महत्वपूर्ण लाभ इसकी प्लास्टिसिटी है। बस विभिन्न विकास कारकों के साथ संस्कृति माध्यम को पूरक करना सह-संस्कृति की उपस्थिति को बदल सकता है। उदाहरण के लिए, मोनो- और सह-संस्कृति अवधि में बीएमपी -2 की उपस्थिति एक ओस्टोजेनिक संवहनी आला बनाती है, जो एएलपी गतिविधि, बाह्य कैल्शियम जमाव, साथ ही ईसीएम असेंबली और जमाव में वृद्धि दिखाती है। इसके विपरीत, एफजीएफ -2 की उपस्थिति में, ओस्टोजेनिक मार्कर अनुपस्थित हैं, और सह-संस्कृति कम पार्श्व सेल एसोसिएशन बनाती है लेकिन अधिक स्पष्ट 3 डी सेल वृद्धि दिखाती है। तथ्य यह है कि एफजीएफ -2 एएलपी गतिविधि को दबा देता है जबकि बीएमपी -2 बिना किसी विकास कारक उपचार की तुलना में मजबूत एएलपी गतिविधि प्राप्त करताहै। फिर भी, एचबीएम-एमएससी स्ट्रोमल घटक में इन बड़े अंतरों के बावजूद, इस काम में दो विकास कारक-उपचारित स्थितियों के लिए माइक्रोवस्कुलर नेटवर्क की सीमा बहुत समान थी। नियंत्रण संस्कृतियों में, केवल कुछ छोटे संवहनी नेटवर्क का गठन किया गया, जो शायद एक खराब संवहनी अस्थि मज्जा आला का प्रतिनिधित्व करता है। इससे पता चलता है कि संस्कृति माध्यम में जोड़े गए विकास कारकों के प्रकार, एकाग्रता और समय को बदलकर, तुलनात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक अच्छी तरह से परिभाषित संवहनी अस्थि मज्जा niches की एक श्रृंखला का उत्पादन किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि संस्कृति की प्रगति और आकृति विज्ञान उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं के इतिहास के आधार पर भिन्न हो सकती है (उदाहरण के लिए, नियमित संस्कृति रखरखाव के दौरान उपयोग की जाने वाली मार्ग संख्या और अलगाव विधि), और परख डिजाइन के दौरान ऐसे कारकों को नियंत्रित करना उचित है।
यहां, इस मॉडल के पहले आवेदन के रूप में, हम 10 μg / mL Bevacizumab के साथ उपचार के लिए इंजीनियर माइक्रोवस्कुलर नेटवर्क की संवेदनशीलता का प्रदर्शन करते हैं। विशेष रूप से, यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि उपयोग किया जाने वाला एल्गोरिदम एंडोथेलियल नेटवर्क को सटीक रूप से पहचान सकता है, क्योंकि कलाकृतियों को अक्सर खराब विकसित नेटवर्क वाली छवियों में उत्पन्न किया जाता है। यदि यह मामला है, तो छवि प्रसंस्करण (विभाजन से पहले और दौरान) के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को अक्सर परीक्षण-और-त्रुटि के आधार पर ठीक करने की आवश्यकता होती है।
दूसरे आवेदन के रूप में, हम मेसेनकाइमल, एंडोथेलियल और कैंसर कोशिकाओं के अनुक्रमिक सीडिंग द्वारा गठित एक उन्नत सह-संस्कृति मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल कैंसर कोशिकाओं, स्ट्रोमा और अस्थि मज्जा के वाहिका के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जो मेटास्टेसिस के दौरान महत्वपूर्ण कारक हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, इस मॉडल का उपयोग दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों और एंजियोजेनेसिस से परे लक्ष्यों के साथ यौगिकों के परीक्षण के लिए किया जा सकता है।
2 डी संस्कृतियों में, कोशिकाओं को फिजियोलॉजिकल माइक्रोएनवायरनमेंटल सिग्नल प्राप्त नहीं होते हैं, स्वाभाविक रूप से होने वाली सेल आकृति विज्ञान प्राप्त नहीं करते हैं, और परिणामस्वरूप, देशी 3 डी वातावरण में कोशिकाओं की तुलना में अलग-अलग अंतर करतेहैं। जब इंजीनियर 3 डी हाइड्रोगेल में उगाया जाता है, तो कोशिकाएं एक अंतर्निहित ईसीएम जमा करती हैं, जो आसंजन साइट प्रदान करती है और सक्रिय रूप से 28,36 को फिर से तैयार किया जा सकता है। यहां, स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए एक सरलीकृत 3 डी मॉडल स्थापित करने के लिए, पोत बनाने वाली कोशिकाओं को इंजीनियर हाइड्रोगेल की सतह पर बीज दिया गया था और छिड़काव की अनुपस्थिति में संवहनी नेटवर्क स्थापित करने की अनुमति दी गई थी। संवहनी संरचनाओं में योगदान देने वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं के 2 डी अनुमानों पर इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन आयोजित किए गए थे। हालांकि, केवल कॉन्फोकल छवियों ने एफजीएफ -2-उत्तेजित नमूनों की तुलना में बीएमपी -2-उत्तेजित नमूनों में 3 डी संवहनी नेटवर्क की कम स्पष्ट वृद्धि का खुलासा किया। इससे पता चलता है कि गठित संवहनी संरचनाओं की लंबाई को कम करके आंका गया था, जबकि उनकी कनेक्टिविटी को कम करके आंका गया था। इसके अतिरिक्त, पेरिवास्कुलर और एंडोथेलियल कोशिकाओं और संवहनी लुमेन गठन के बीच बातचीत की जांच नहीं की गई है। इन पहलुओं, विशेष रूप से दवा उपचार प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में, आगे ध्यान देने की आवश्यकता होगी। अंत में, पहले व्यापक 3 डी संवहनी नेटवर्क स्थापित करने के लिए परिष्कृत प्रोटोकॉल और उसके बाद ही उनके ओस्टोजेनिक भेदभाव को प्रेरित करना अधिक शारीरिक अस्थि और अस्थि मज्जा मॉडल उत्पन्न करने के लिए वांछनीय होगा।
कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत मॉडल अत्यधिक बहुमुखी है और इसे आसानी से विशिष्ट अनुप्रयोगों की ओर तैयार किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न स्रोतों से मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है। यह ज्ञात है कि वसा ऊतक एमएससी और गर्भनाल एमएससी बीएम-एमएससी की तुलना में विभिन्न एंजियोजेनिक कारकों को व्यक्त करते हैं, और उन्हें आसानी से वैकल्पिक स्ट्रोमल घटक37 के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। पहले से ही परिभाषित अस्थि मज्जा आला से अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग एचयूवीईसी के बजाय भी किया जा सकता है। कोई व्यक्तिगत चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए रोगी-व्युत्पन्न, अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं से मेल खाने वाले सह-संस्कृति के साथ सह-संस्कृति भी स्थापित कर सकता है, जैसा कि हाल ही में संवहनी मांसपेशी सह-संस्कृतियोंके लिए सुझाया गया है। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोगेल प्लेट का डिज़ाइन उज्ज्वल-क्षेत्र और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दोनों के साथ संस्कृति की अनुदैर्ध्य निगरानी की अनुमति देता है, इस प्रकार उपयोगकर्ता को आवेदन के आधार पर संस्कृति समय को छोटा या विस्तारित करने की संभावना प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, सीडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल घनत्व को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है ताकि सेल नेटवर्क के गठन में तेजी या देरी हो यदि इस प्रोटोकॉल की तुलना में कम या लंबे अवलोकन समय की आवश्यकता होती है। किसी भी मामले में, शीट जैसी संरचनाओं में सेल अतिवृद्धि से बचने के लिए सावधानी की आवश्यकता होती है, जिससे हाइड्रोगेल का संकुचन और अंततः सेल डिटेचमेंट हो सकता है।
अंत में, इस मॉडल का उपयोग करके परख की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रदर्शन किया जा सकता है। जीवित या निश्चित संस्कृतियों में किए गए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और माइक्रोस्कोपी के अलावा, 3 डी संस्कृतियों को एंजाइमेटिक रूप से पचाया जा सकता है, और कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और किसी भी प्रकार के जैव रासायनिक परख के अधीन किया जा सकता है। फ्लोरोमेट्रिक परख का उपयोग करके सेल लाइसेट में एएलपी गतिविधि और डीएनए सामग्री परिमाणीकरण के निर्धारण का प्रदर्शन करते हैं, लेकिन सिस्टम पीसीआर, आरएनएसेक और प्रोटिओमिक्स सहित कई अन्य तकनीकों के साथ संगत है। यदि वांछित परख की संवेदनशीलता बहुत अधिक नहीं है, तो परख के लिए उपलब्ध नमूने की मात्रा बढ़ाने के लिए एक से अधिक कुएं से नमूने पूल कर सकते हैं। यदि वांछित अनुप्रयोग को तेजी से जेल विघटन की आवश्यकता होती है, तो प्लेट के कक्षीय झटकों को कुओं में भंवर गठन सुनिश्चित करने के लिए पाचन समाधान की छोटी मात्रा के साथ संयोजन में लागू किया जा सकता है, यह मानते हुए कि प्लेट पर सभी कुओं का उपयोग इस तरह से किया जाएगा (जीवित संस्कृतियां इस तरह के कठोर हैंडलिंग के प्रति संवेदनशील हैं)। सारांश में, हम यहां एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो यदि वर्णित के रूप में उपयोग किया जाता है, तो एक इन विट्रो मॉडल की पीढ़ी की गारंटी देता है जो ओस्टोजेनिक संवहनी niches के प्रमुख पहलुओं को पुन: प्रस्तुत करता है लेकिन दर्जी किए गए अनुप्रयोगों के लिए संशोधित होने के लिए पर्याप्त बहुमुखी भी है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक तरल हैंडलिंग उपकरणों के साथ तकनीकी सहायता के लिए रिकार्डो अर्बनेट और एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ समर्थन के लिए रोडी ओडाबासी को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 310030E_202429 और 205321_204318) और एक्टिका टेक्नोलॉजीज एजी द्वारा वित्तपोषित किया गया था।
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
BSA | AppliChem | A1391 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
FBS | Gibco | 10500-064 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
hBM-MSCs | – | – | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MDA-MB-231 breast cancer cell line | – | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
MEMα | Gibco | 22571-038 | |
Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
Multimode imaging reader – fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
PBS | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween20 | AppliChem | A4974 | |
U2OS osteosarcoma cell line | – | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |