प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस के दौरान ऑटोएंटीजन की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने में माइकोबैक्टीरियम पैराट्यूबरकुलोसिस की सहायक गतिविधि
Summary
यहां, हम सी 57बीएल /6 चूहों में प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस को सक्रिय रूप से प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें इम्युनोजेनिक एपिटोप माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) 35-55 का उपयोग किया जाता है, जो अपूर्ण फ्रायंड के सहायक में निलंबित होता है जिसमें गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस होते हैं।
Abstract
माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) द्वारा प्रेरित प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) को निष्क्रिय माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस युक्त पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) में एक एमओजी पेप्टाइड इमल्सीफाइड द्वारा टीकाकरण की आवश्यकता होती है। माइकोबैक्टीरियम के एंटीजेनिक घटक टी-कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए डेंड्राइटिक कोशिकाओं को सक्रिय करते हैं ताकि साइटोकिन्स का उत्पादन किया जा सके जो टोल-जैसे रिसेप्टर्स के माध्यम से टीएच 1 प्रतिक्रिया को बढ़ावा देते हैं। इसलिए, एंटीजेनिक चुनौती के दौरान मौजूद माइकोबैक्टीरिया की मात्रा और प्रजातियां सीधे ईएई के विकास से संबंधित हैं। यह विधि पत्र सी 57बीएल /6 चूहों में ईएई को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें एक संशोधित अपूर्ण फ्रायंड के सहायक का उपयोग किया जाता है जिसमें गर्मी से मारे गए माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस स्ट्रेन के -10 शामिल हैं।
पैराट्यूबरकुलोसिस, माइकोबैक्टीरियम एवियम कॉम्प्लेक्स का एक सदस्य, जुगाली करने वालों में जॉन की बीमारी का प्रेरक एजेंट है और मल्टीपल स्केलेरोसिस सहित कई मानव टी-सेल-मध्यस्थता विकारों के लिए जोखिम कारक के रूप में पहचाना गया है। कुल मिलाकर, माइकोबैक्टीरियम पैराट्यूबरकुलोसिस के साथ प्रतिरक्षित चूहों ने 4 मिलीग्राम / एमएल की समान खुराक पर एम ट्यूबरकुलोसिस एच 37 आरए के तनाव वाले सीएफए के साथ प्रतिरक्षित चूहों की तुलना में पहले शुरुआत और अधिक बीमारी की गंभीरता दिखाई। माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस (एमएपी) स्ट्रेन के -10 के एंटीजेनिक निर्धारक प्रभावक चरण के दौरान एक मजबूत टीएच 1 सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रेरित करने में सक्षम थे, जो टी-लिम्फोसाइटों (सीडी 4 + सीडी 27 +), डेंड्राइटिक कोशिकाओं (सीडी 11 सी + आई-ए / आई-ई +), और मोनोसाइट्स (सीडी 11 बी + सीडी 115 +) सीएफए के साथ प्रतिरक्षित चूहों की तुलना में प्लीहा में। इसके अलावा, एमओजी पेप्टाइड के लिए प्रोलिफेरेटिव टी-सेल प्रतिक्रिया एम पैराट्यूबरकुलोसिस-प्रतिरक्षित चूहों में सबसे अधिक दिखाई दी। फॉर्मूलेशन में एम. पैराट्यूबरकुलोसिस युक्त सहायक में इमल्सीफाइड एन्सेफेलिटोजेन (जैसे, एमओजी35-55) का उपयोग ईएई के प्रेरण चरण के दौरान माइलिन एपिटोप-विशिष्ट सीडी 4 + टी-कोशिकाओं को प्राइमिंग के लिए डेंड्राइटिक कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए एक वैकल्पिक और मान्य विधि हो सकती है।
Introduction
प्रायोगिक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मानव डिमाइलेटिंगविकारों के अध्ययन के लिए एक सामान्य मॉडल है। ईएई के कई मॉडल हैं: शक्तिशाली सहायक दवाओं के साथ संयोजन में विभिन्न माइलिन पेप्टाइड्स का उपयोग करके सक्रिय टीकाकरण, माइलिन-विशिष्ट सीडी 4 + लिम्फोसाइटों के इन विट्रो ट्रांसफर द्वारा निष्क्रिय टीकाकरण, और सहज ईएई2 के ट्रांसजेनिक मॉडल। इनमें से प्रत्येक मॉडल में विशिष्ट विशेषताएं हैं जो ईएई के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने की अनुमति देती हैं, जैसे कि शुरुआत, प्रभावकारक चरण या पुरानी चरण। ईएई का माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) मॉडल क्रोनिक न्यूरोइन्फ्लेमेशन और डिमाइलिनेशन के प्रतिरक्षा-मध्यस्थता तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है, क्योंकि यह मोनोन्यूक्लियर भड़काऊ घुसपैठ, परिधीय सफेद पदार्थ में विघटन और रोग के चरम1 के बाद कम वसूली की विशेषता है।
एमओजी-ईएई को पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) में पेप्टाइड एमओजी35-55 के साथ अतिसंवेदनशील चूहों के टीकाकरण से प्रेरित किया जाता है, इसके बाद पर्टुसिस विष का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन होता है। यह रक्त-मस्तिष्क बाधा की पारगम्यता को बढ़ाता है और परिधि में सक्रिय माइलिन-विशिष्ट टी-कोशिकाओं को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) तक पहुंचने की अनुमति देता है, जहां उन्हें फिरसे सक्रिय किया जाएगा। सीएफए एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं द्वारा एंटीजन अपटेक को बढ़ाकर और ह्यूमरल- और सेल-मध्यस्थताप्रतिक्रियाओं से संबंधित साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर ईएई के प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह तंत्र मुख्य रूप से तेल में मारे गए माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस इमल्सीफाइड की उपस्थिति के कारण है, जिसके घटकप्रतिरक्षा प्रणाली के लिए एक मजबूत उत्तेजना प्रदान करते हैं। वास्तव में, ईएई का प्रेरण सीधे एंटीजेनिक चुनौती6 के दौरान मौजूद माइकोबैक्टीरियम की मात्रा से संबंधित है।
अपूर्ण फ्रायंड के सहायक7 के साथ-साथ सहायक संयोजन8 के प्रभाव में माइकोबैक्टीरियम ब्यूटिरिकम जैसे अन्य मारे गए माइकोबैक्टीरिया के अलावा, ईएई के नैदानिक पाठ्यक्रम को संशोधित कर सकते हैं और परिणामस्वरूप परिणामों की प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। माइकोबैक्टीरियम एवियम उप-प्रजाति पैराट्यूबरकुलोसिस (एमएपी), जुगाली करने वालों में जॉन की बीमारी का ईटियोलॉजिकल एजेंट, मानव सीएनएस 9 के भड़काऊ विकारों से जुड़ा हुआ है, क्योंकि इसके एंटीजेनिक घटक मल्टीपल स्केलेरोसिस और न्यूरोमाइलाइटिस ऑप्टिका स्पेक्ट्रम विकार9 वाले रोगियों में एक मजबूत ह्यूमर- और सेल-मध्यस्थता प्रतिक्रिया प्राप्त करने में सक्षम हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हम सीएफए में एम. ट्यूबरकुलोसिस को एम. पैराट्यूबरकुलोसिस के साथ बदलकर एमओजी-ईएई को प्रेरित करने के लिए एक वैकल्पिक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि दिखाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने एम. पैराट्यूबरकुलोसिस10 युक्त सहायक में पेप्टाइड एमओजी35-55 इमल्सीफाइड का उपयोग करके सी 57बीएल /6 जे चूहों में गंभीर ईएई को सक्रिय रूप से प्रेरित करने के लिए एक मजबूत वैकल्पिक प्रोटोकॉ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को विज्ञान के प्रचार के लिए जापानी सोसायटी से अनुदान से समर्थन मिला (अनुदान संख्या 10)। जेपी 23K14675)।
Materials
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114 (2013).
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064 (2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O’Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216 (2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179 (2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477 (2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
