Her presenterer vi en alternativ protokoll for aktivt å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt hos C57BL/6 mus, ved bruk av den immunogene epitopen myelinoligodendrocytt glykoprotein (MOG) 35-55 suspendert i ufullstendig Freunds adjuvans som inneholder den varmedrepte Mycobacterium avium underarten paratuberculosis.
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) indusert av myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG) krever immunisering av et MOG-peptid emulgert i komplett Freunds adjuvans (CFA) som inneholder inaktivert Mycobacterium tuberculosis. De antigene komponentene i mykobakteriet aktiverer dendrittiske celler for å stimulere T-celler til å produsere cytokiner som fremmer Th1-responsen via toll-lignende reseptorer. Derfor er mengden og arten av mykobakterier som er tilstede under den antigene utfordringen direkte relatert til utviklingen av EAE. Denne metodeartikkelen presenterer en alternativ protokoll for å indusere EAE i C57BL/6-mus ved bruk av en modifisert ufullstendig Freunds adjuvans som inneholder den varmedrepte Mycobacterium avium-underarten paratuberkulosestamme K-10.
M. paratuberculosis, et medlem av Mycobacterium avium-komplekset, er årsaken til Johnes sykdom hos drøvtyggere og har blitt identifisert som en risikofaktor for flere humane T-cellemedierte lidelser, inkludert multippel sklerose. Totalt sett viste mus immunisert med Mycobacterium paratuberculosis tidligere debut og større sykdomsalvorlighetsgrad enn mus immunisert med CFA som inneholdt stammen av M. tuberculosis H37Ra i samme doser på 4 mg / ml. De antigene determinantene til Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) stamme K-10 var i stand til å indusere en sterk Th1 cellulær respons under effektorfasen, karakterisert ved signifikant høyere antall T-lymfocytter (CD4+ CD27+), dendrittiske celler (CD11c+ I-A/I-E+) og monocytter (CD11b+ CD115+) i milten sammenlignet med mus immunisert med CFA. Videre syntes den proliferative T-celleresponsen på MOG-peptidet å være høyest hos M. paratuberculosis-immuniserte mus. Bruk av et encefalittogen (f.eks. MOG35-55) emulgert i en adjuvans inneholdende M. paratuberculosis i formuleringen kan være en alternativ og validert metode for å aktivere dendrittiske celler for priming av myelinepitopspesifikke CD4+ T-celler under induksjonsfasen av EAE.
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en vanlig modell for studier av humane demyeliniserende lidelser1. Det finnes flere modeller av EAE: aktiv immunisering ved bruk av forskjellige myelinpeptider i kombinasjon med potente adjuvanser, passiv immunisering ved in vitro-overføring av myelinspesifikke CD4+ -lymfocytter og transgene modeller av spontane EAE2. Hver av disse modellene har spesifikke funksjoner som gjør det mulig å studere forskjellige aspekter av EAE, for eksempel utbrudd, effektorfase eller kronisk fase. Myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG) -modellen til EAE er en god modell for å studere immunmedierte mekanismer for kronisk nevroinflammasjon og demyelinisering, da den er preget av mononukleær inflammatorisk infiltrasjon, demyelinisering i perifer hvit substans og redusert utvinning etter sykdomstoppen1.
MOG-EAE induseres ved immunisering av følsomme mus med peptidet MOG35-55 i komplett Freunds adjuvans (CFA), etterfulgt av en intraperitoneal injeksjon av kikhostetoksin. Dette øker permeabiliteten til blod-hjernebarrieren og gjør at myelinspesifikke T-celler aktivert i periferien kan nå sentralnervesystemet (CNS), hvor de vil bli reaktivert3. CFA spiller en nøkkelrolle i induksjonen av EAE ved å øke antigenopptaket av antigenpresenterende celler og ekspresjonen av cytokiner relatert til humoral- og cellemedierte responser4. Denne mekanismen skyldes hovedsakelig tilstedeværelsen av drepte Mycobacterium tuberculosis emulgert i olje, hvis komponenter gir en sterk stimulans for immunsystemet5. Faktisk er induksjonen av EAE direkte relatert til mengden mykobakterie som er tilstede under den antigene utfordringen6.
Tillegg av andre drepte mykobakterier, som Mycobacterium butyricum, til ufullstendig Freunds adjuvans7, samt effekten av adjuvante kombinasjoner8, kan modulere det kliniske forløpet av EAE og følgelig påvirke reproduserbarheten av resultatene. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), det etiologiske agensen av Johnes sykdom hos drøvtyggere, har vært assosiert med inflammatoriske lidelser i det humane CNS 9, da dets antigene komponenter er i stand til å fremkalle en sterk humoral- og cellemediert respons hos pasienter med multippel sklerose og neuromyelitis optica-spektrumforstyrrelse9. Derfor viser vi i denne protokollen en alternativ og reproduserbar metode for å indusere MOG-EAE ved å erstatte M. tuberculosis i CFA med M. paratuberculosis.
Vi demonstrerte en robust alternativ protokoll for aktivt å indusere alvorlig EAE i C57BL/6J-mus ved bruk av peptidet MOG35-55 emulgert i en adjuvans inneholdende M. paratuberculosis10. Induksjonen av EAE ved denne metoden resulterte i en mer alvorlig sykdom enn den som induseres av den vanlige protokollen med CFA. Denne forskjellen kan skyldes de forskjellige lipidiske komponentene i celleveggen til mykobakteriene11. Faktisk, i motsetning til andre myk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet mottok støtte fra et stipend fra Japanese Society for the Promotion of Science (stipend nr. JP 23K14675).
anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |