En neonatal heterotopisk hjärttransplantationsmodell för råtta för studier av endotelial till mesenkymal övergång
Summary
Detta arbete presenterar en djurmodell av endotel-till-mesenkymal övergångsinducerad fibros, som ses vid medfödda hjärtfel såsom kritisk aortastenos eller hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom, vilket möjliggör detaljerad histologisk vävnadsutvärdering, identifiering av regulatoriska signalvägar och testning av behandlingsalternativ.
Abstract
Endokardiell fibroelastos (EFE), som definieras som ackumulering av subendokardiell vävnad, har stor inverkan på utvecklingen av vänster kammare (LV) och utesluter patienter med medfödd kritisk aortastenos och hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) från botande anatomisk biventrikulär kirurgisk reparation. Kirurgisk resektion är för närvarande det enda tillgängliga behandlingsalternativet, men EFE återkommer ofta, ibland med ett ännu mer infiltrativt tillväxtmönster i det intilliggande hjärtmuskeln.
För att bättre förstå de underliggande mekanismerna för EFE och för att utforska terapeutiska strategier utvecklades en djurmodell som lämpar sig för prekliniska tester. Djurmodellen tar hänsyn till att EFE är en sjukdom i det omogna hjärtat och är förknippad med flödesstörningar, vilket stöds av kliniska observationer. Således är den heterotopiska hjärttransplantationen av neonatala råttdonatorhjärtan grunden för denna modell.
Ett neonatalt råtthjärta transplanteras till en ung råttas buk och kopplas till mottagarens infrarenala aorta och nedre hålven. Medan perfusion av kranskärlen bevarar donatorhjärtats livsduglighet, inducerar flödesstagnation i LV EFE-tillväxt i det mycket omogna hjärtat. Den bakomliggande mekanismen för EFE-bildning är övergången av endokardiella endotelceller till mesenkymala celler (EndMT), vilket är en väl beskriven mekanism för tidig embryonal utveckling av klaffar och septa men också den främsta orsaken till fibros vid hjärtsvikt. EFE-bildning kan observeras makroskopiskt inom några dagar efter transplantationen. Transabdominell ekokardiografi används för att övervaka transplantatets livsduglighet, kontraktilitet och öppenhet hos anastomoserna. Efter avlivning skördas EFE-vävnaden och den uppvisar samma histopatologiska egenskaper som human EFE-vävnad från HLHS-patienter.
Denna in vivo-modell gör det möjligt att studera mekanismerna för EFE-utveckling i hjärtat och testa behandlingsalternativ för att förhindra denna patologiska vävnadsbildning och ger möjlighet till en mer generaliserad undersökning av EndMT-inducerad fibros.
Introduction
Endokardiell fibroelastos (EFE), definierad av ackumulering av kollagen och elastiska fibrer i subendokardiell vävnad, presenterar sig som ett pärlemorskimrande eller ogenomskinligt förtjockat endokardiet; EFE genomgår den mest aktiva tillväxten under fosterperioden och den tidiga spädbarnstiden1. I en obduktionsstudie var 70 % av fallen med hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) associerade med förekomst av EFE2.
Celler som uttrycker markörer för fibroblaster är den huvudsakliga cellpopulationen i EFE, men dessa celler uttrycker också samtidigt endokardiella endotelmarkörer, vilket är en indikation på ursprunget till dessa EFE-celler. Vår grupp har tidigare fastställt att den underliggande mekanismen för EFE-bildning involverar en fenotypisk förändring av endokardiella endotelceller till fibroblaster genom endotel-till-mesenkymal övergång (EndMT)3. EndMT kan detekteras med hjälp av immunhistokemisk dubbelfärgning för endotelmarkörer såsom kluster av differentiering (CD) 31 eller vaskulär endotel (VE)-cadherin (CD144) och fibroblastmarkörer (t.ex. alfa-glatt muskelaktin, α-SMA). Dessutom har vi tidigare fastställt TGF-ß-vägens reglerande roll i denna process med aktivering av transkriptionsfaktorerna SLUG, SNAIL och TWIST3.
EndMT är en fysiologisk process som sker under embryonal hjärtutveckling och leder till bildandet av septa och klaffar från endokardiella kuddar4, men det orsakar också organfibros vid hjärtsvikt, njurfibros eller cancer och spelar en nyckelroll vid vaskulär ateroskleros 5,6,7,8. EndMT i hjärtfibros regleras huvudsakligen genom TGF-β-vägen, som vi och andra har rapporterat 3,9. Olika stimuli har beskrivits inducera EndMT: inflammation 10, hypoxi 11, mekaniska förändringar 12 och flödesstörningar, inklusive förändringar av det intrakavitära blodflödet 13, och EndMT kan också vara en följd av en genetisk sjukdom 14.
Denna djurmodell utvecklades med hjälp av nyckelkomponenterna i hjärtats EFE-utveckling, som är omognad och förändringar av det intrakavitära blodflödet, särskilt flödesstagnation. Omognad uppfylldes genom att använda neonatala råtthjärtan som donatorer, eftersom neonatala råttor är kända för att vara utvecklingsmässigt omogna direkt efter födseln. Heterotopisk hjärttransplantation erbjöd intrakavitär flödesbegränsning15.
Ur klinisk synvinkel gör denna djurmodell det möjligt att bättre undersöka effekten av EndMT på den växande vänsterkammaren (LV). Den tillväxthämning som påförts fostrets och det neonatala hjärtat genom EndMT-inducerad EFE-bildning16 utesluter patienter med obstruktion av utflödeskanalen för vänster kammare (LVOTO) såsom medfödd kritisk aortastenos och hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) från botande anatomisk biventrikulär kirurgisk reparation17. Denna djurmodell underlättar studier av de cellulära mekanismerna och regleringen av vävnadsbildning genom EndMT och möjliggör testning av farmakologiska behandlingsalternativ 3,18.
Transabdominell ekokardiografi används för att övervaka transplantatets livsduglighet, kontraktilitet och öppenhet hos anastomoserna. Efter eutanasi kan EFE-bildning observeras makroskopiskt inom 3 dagar efter transplantationen. EFE-vävnad uppvisar samma histopatologiska egenskaper som human EFE-vävnad från patienter med LVOTO.
Därför kan denna djurmodell, även om den utvecklats för pediatrisk användning i spektrumet av HLHS, tillämpas vid studier av olika sjukdomar baserat på den molekylära mekanismen för EndMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna djurmodell för heterotopisk transplantation av ett neonatalt donatorråtthjärta till mottagarens buk skapar möjligheten att studera EndMT-härledd fibros genom detaljerad histologisk vävnadsutvärdering, identifiera regulatoriska signalvägar och testa behandlingsalternativ. Eftersom EndMT är den underliggande mekanismen för fibrotiska sjukdomar i hjärtat har denna modell stort värde inom pediatrisk hjärtkirurgi och därefter. I denna modell kan många faktorer påverka resultatet av proceduren negativt. K…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Additional Ventures – Single Ventricle Research Fund (SVRF) och Single Ventricle Expansion Fund (till I.F.) och ett Marietta Blau-stipendium från OeAD-GmbH från medel från det österrikiska federala ministeriet för utbildning, vetenskap och forskning BMBWFC (till G.G.).
Materials
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R. Changing concepts of endocardial fibroelastosis. Cardiology in the Young. 20 (2), 115-123 (2010).
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 565-577 (2018).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
