Summary

Screening dei canali ionici nelle cellule tumorali

Published: June 16, 2023
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Summary

Il targeting farmacologico dei canali ionici è un approccio promettente per il trattamento dei tumori solidi. Vengono forniti protocolli dettagliati per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule tumorali e dosare gli effetti dei modulatori dei canali ionici sulla vitalità del cancro.

Abstract

I canali ionici sono fondamentali per lo sviluppo cellulare e il mantenimento dell’omeostasi cellulare. La perturbazione della funzione dei canali ionici contribuisce allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi o canalopatie. Le cellule tumorali utilizzano canali ionici per guidare il proprio sviluppo, nonché per migliorare come tumore e assimilare in un microambiente che include varie cellule non cancerose. Inoltre, l’aumento dei livelli di fattori di crescita e ormoni all’interno del microambiente tumorale può comportare una maggiore espressione dei canali ionici, che contribuisce alla proliferazione e alla sopravvivenza delle cellule tumorali. Pertanto, il targeting farmacologico dei canali ionici è potenzialmente un approccio promettente per il trattamento di tumori maligni solidi, compresi i tumori cerebrali primari e metastatici. Qui vengono descritti i protocolli per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule cancerose e gli approcci per analizzare i modulatori dei canali ionici per determinare il loro impatto sulla vitalità del cancro. Questi includono la colorazione di una cellula (s) per un canale ionico, testare lo stato polarizzato dei mitocondri, stabilire la funzione del canale ionico usando l’elettrofisiologia ed eseguire saggi di vitalità per valutare la potenza del farmaco.

Introduction

Le proteine di trasporto della membrana sono fondamentali per la comunicazione tra le cellule e per il mantenimento dell’omeostasi cellulare. Tra le proteine di trasporto di membrana, i canali ionici servono a guidare la crescita e lo sviluppo delle cellule e a mantenere lo stato delle cellule in ambienti difficili e mutevoli. È stato anche riportato che i canali ionici guidano e supportano lo sviluppo di tumori solidi, sia a livello sistemico che nel sistema nervoso centrale (SNC)1,2. Ad esempio, i canali KCa3.1 sono responsabili della regolazione del potenziale di membrana e del controllo del volume cellulare, che è importante nella regolazione del ciclo cellulare. È stato riportato che i canali difettosi di KCa3.1 contribuiscono alla proliferazione anormale delle cellule tumorali3. Inoltre, i canali ionici possono contribuire alla diffusione metastatica dei tumori. I canali del potenziale recettore transitorio (TRP), ad esempio, sono coinvolti nell’afflusso di Ca 2+ e Mg2+; Questo afflusso attiva diverse chinasi e proteine da shock termico che funzionano per regolare la matrice extracellulare che circonda un tumore, che è, a sua volta, importante per iniziare le metastasi del cancro4.

Poiché i canali ionici possono contribuire allo sviluppo di tumori, possono anche essere obiettivi per il trattamento del cancro correlato ai farmaci. Ad esempio, la resistenza alle modalità di trattamento, compresa la chemioterapia e la nuova immunoterapia, è correlata alla disregolazione della funzione dei canali ionici 5,6,7. Inoltre, i canali ionici stanno emergendo come importanti bersagli farmacologici per impedire la crescita e lo sviluppo dei tumori, con farmaci a piccole molecole riproposti (approvati dalla FDA) in fase di esame, nonché biopolimeri, compresi gli anticorpi monoclonali 1,2,8,9. Mentre ci sono stati molti progressi su questo fronte, la scoperta di farmaci per il cancro del canale ionico rimane sottosviluppata. Ciò è in parte dovuto alle sfide uniche dello studio dei canali ionici nelle cellule tumorali. Ad esempio, ci sono limitazioni tecniche nella creazione di saggi elettrofisiologici per composti ad azione lenta e differenze temporali nell’attivazione del canale e nell’azione del farmaco. Inoltre, la solubilità dei composti può anche impedire il progresso, poiché la maggior parte dei sistemi di elettrofisiologia automatizzati comunemente in uso oggi utilizzano substrati idrofobici, che possono contribuire agli artefatti a seguito dell’adsorbimento dei composti. Inoltre, le grandi terapie molecolari bioorganiche come prodotti naturali, peptidi e anticorpi monoclonali sono tecnicamente difficili da esaminare utilizzando saggi elettrofisiologici convenzionali10. Infine, le proprietà bioelettriche delle cellule tumorali rimangono poco conosciute11.

Nel frattempo, la colorazione a immunofluorescenza dei canali ionici è spesso impegnativa. Ciò è dovuto, in parte, alla complessità delle loro strutture e del loro contesto nella membrana, che influiscono sulla capacità di generare e impiegare anticorpi per gli studi di microscopia. È particolarmente importante che gli anticorpi utilizzati per colorare i canali ionici siano convalidati per specificità, affinità e riproducibilità. Gli anticorpi commerciali per i canali ionici dovrebbero essere presi in considerazione sulla base della loro strategia di convalida e del record di pubblicazione. Gli esperimenti dovrebbero includere controlli negativi per dimostrare la mancanza di legame non specifico mediante knockdown o knockout della proteina bersaglio. In alternativa, le linee cellulari in cui la proteina bersaglio è assente o in bassa abbondanza sulla base di mRNA o determinazioni proteiche possono servire come controlli negativi. Ad esempio, questo studio mostra la localizzazione della subunità del recettore (GABA) Gabra5 in una linea cellulare di medulloblastoma (D283). Le cellule D283 con un knockdown di siRNA e le cellule Daoy, un’altra linea cellulare di medulloblastoma cerebellare, sono state colorate per Gabra5 e non hanno mostrato alcuna colorazione apprezzabile (dati non mostrati).

Qui vengono presentati metodi per analizzare e saggiare la funzione dei canali ionici, nonché l’effetto dei modulatori dei canali ionici sulle cellule tumorali. Sono previsti protocolli per (1) colorare le cellule per un canale ionico, (2) testare lo stato polarizzato dei mitocondri, (3) stabilire la funzione del canale ionico usando l’elettrofisiologia e (4) convalidare il farmaco in vitro. Questi protocolli enfatizzano gli studi del recettore dell’acido gamma-aminobutirrico di tipo A (GABAA) 2,12,13,14,15,16, un canale anionico cloruro e il principale recettore inibitorio dei neurotrasmettitori. Tuttavia, i metodi qui presentati si applicano allo studio di molte altre cellule tumorali e canali ionici.

Protocol

1. Immunomarcatura dei canali ionici in cellule in coltura Preparazione delle celle e set-up sperimentaleMantenere le cellule come una coltura in crescita attiva in boccette di coltura da 75 cm2 . Far passare le cellule una volta fino a quando non diventano confluenti al 50% -90%, a seconda del tempo di raddoppio della linea cellulare utilizzata.NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate cellule D283, una linea cellulare di medulloblastoma del gruppo 3. Raccogliere le c…

Representative Results

Sopra sono selezionate le procedure che possono essere impiegate per caratterizzare i canali ionici nelle cellule cancerose. Il primo protocollo evidenzia la colorazione di un canale ionico. Come dettagliato, ci sono molte sfide quando si colora un canale ionico o, se è per questo, qualsiasi proteina presente nella membrana extracellulare. Mostrato in Figura 1 è la colorazione per una subunità del recettore pentamerico GABAA. Il secondo protocollo evidenzia i risultati dei test…

Discussion

I cambiamenti nella funzione dei canali ionici alterano le cascate di segnalazione intracellulare, che possono influire sul funzionamento complessivo di una cellula. Negli ultimi dieci anni, è diventato sempre più chiaro che i canali ionici sono importanti per la crescita e le metastasi delle cellule tumorali. È importante sottolineare che molti canali ionici sono obiettivi primari per le terapie approvate mirate a una vasta gamma di disturbi24. I ricercatori hanno sondato se i canali ionici po…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono il sostegno della Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation a S.S. e il finanziamento della Harold C. Schott Foundation della Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, a S.S.

Materials

ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS – Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

References

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Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

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