Summary

Rastreamento de Canais Iônicos em Células Cancerosas

Published: June 16, 2023
doi:

Summary

O direcionamento farmacológico dos canais iônicos é uma abordagem promissora para o tratamento de tumores sólidos. Protocolos detalhados são fornecidos para caracterizar a função de canais iônicos em células cancerosas e avaliar os efeitos de moduladores de canais iônicos na viabilidade do câncer.

Abstract

Os canais iônicos são críticos para o desenvolvimento celular e manutenção da homeostase celular. A perturbação da função dos canais iônicos contribui para o desenvolvimento de uma ampla gama de distúrbios ou canalopatias. As células cancerosas utilizam canais iônicos para impulsionar seu próprio desenvolvimento, bem como para melhorar como um tumor e assimilar em um microambiente que inclui várias células não cancerosas. Além disso, aumentos nos níveis de fatores de crescimento e hormônios dentro do microambiente tumoral podem resultar em maior expressão de canais iônicos, o que contribui para a proliferação e sobrevivência das células cancerígenas. Assim, o direcionamento farmacológico de canais iônicos é potencialmente uma abordagem promissora para o tratamento de neoplasias sólidas, incluindo cânceres cerebrais primários e metastáticos. Neste trabalho, são descritos protocolos para caracterizar a função de canais iônicos em células cancerosas e abordagens para analisar moduladores de canais iônicos para determinar seu impacto na viabilidade do câncer. Estes incluem a coloração de uma célula (s) para um canal iônico (s), testar o estado polarizado da mitocôndria, estabelecer a função do canal iônico usando eletrofisiologia e realizar ensaios de viabilidade para avaliar a potência da droga.

Introduction

As proteínas transportadoras de membrana são fundamentais para a comunicação entre as células, bem como para a manutenção da homeostase celular. Entre as proteínas de transporte de membrana, os canais iônicos servem para impulsionar o crescimento e desenvolvimento das células e para manter o estado das células em ambientes desafiadores e em mudança. Também tem sido relatado que canais iônicos conduzem e apoiam o desenvolvimento de tumores sólidos, tanto sistemicamente quanto no sistema nervoso central (SNC)1,2. Por exemplo, os canais de KCa3.1 são responsáveis por regular o potencial de membrana e controlar o volume celular, o que é importante na regulação do ciclo celular. Canais defeituosos de KCa3.1 têm sido relatados como contribuintes para a proliferação anormal de célulastumorais3. Além disso, os canais iônicos podem contribuir para a disseminação metastática de cânceres. Canais de potencial receptor transitório (TRP), por exemplo, estão envolvidos no influxo de Ca 2+ e Mg2+; Esse influxo ativa várias quinases e proteínas de choque térmico que têm a função de regular a matriz extracelular ao redor de um tumor, o que é, por sua vez, importante para iniciar a metástase docâncer4.

Uma vez que os canais iónicos podem contribuir para o desenvolvimento de cancros, podem também ser alvos para o tratamento do cancro relacionado com medicamentos. Por exemplo, a resistência às modalidades de tratamento, incluindo quimioterapia e nova imunoterapia, está relacionada à desregulação da função dos canais iônicos 5,6,7. Além disso, canais iônicos estão emergindo como importantes alvos de fármacos para impedir o crescimento e desenvolvimento de cânceres, sendo examinados fármacos reaproveitados de pequenas moléculas (aprovados pela FDA), bem como biopolímeros, incluindo anticorposmonoclonais 1,2,8,9. Embora tenha havido muito progresso nessa frente, a descoberta de medicamentos para o câncer de canal iônico permanece subdesenvolvida. Isto é em parte devido aos desafios únicos de estudar os canais iônicos em células cancerosas. Por exemplo, existem limitações técnicas na montagem de ensaios eletrofisiológicos para compostos de ação lenta e diferenças temporais na ativação de canais e ação de drogas. Além disso, a solubilidade dos compostos também pode impedir o progresso, já que a maioria dos sistemas de eletrofisiologia automatizados comumente usados atualmente utilizam substratos hidrofóbicos, que podem contribuir para artefatos como resultado da adsorção de compostos. Além disso, grandes terapêuticas moleculares bioorgânicas, como produtos naturais, peptídeos e anticorpos monoclonais, são tecnicamente desafiadoras de rastrear usando ensaios eletrofisiológicos convencionais10. Finalmente, as propriedades bioelétricas das células cancerosas permanecem pouco compreendidas11.

Enquanto isso, a coloração por imunofluorescência dos canais iônicos é muitas vezes desafiadora. Isso se deve, em parte, à complexidade de suas estruturas e seu contexto na membrana, que impactam a capacidade de gerar e empregar anticorpos para estudos de microscopia. É especialmente importante que os anticorpos usados para corar os canais iônicos sejam validados quanto à especificidade, afinidade e reprodutibilidade. Anticorpos comerciais para canais iônicos devem ser considerados com base em sua estratégia de validação e registro de publicação. Os experimentos devem incluir controles negativos para demonstrar a falta de ligação inespecífica por knockdown ou knockout da proteína-alvo. Alternativamente, linhagens celulares nas quais a proteína-alvo está ausente ou em baixa abundância com base em determinações de RNAm ou proteínas podem servir como controles negativos. Por exemplo, este estudo mostra a localização da subunidade do receptor (GABA) Gabra5 em uma linhagem celular de meduloblastoma (D283). Células D283 com knockdown de siRNA e células Daoy, outra linhagem celular de meduloblastoma cerebelar, foram coradas para Gabra5 e não apresentaram coloração apreciável (dados não mostrados).

Aqui, são apresentados métodos para analisar e testar a função dos canais iônicos, bem como o efeito dos moduladores dos canais iônicos sobre as células cancerosas. São fornecidos protocolos para (1) coloração de células para um canal iônico, (2) teste do estado polarizado das mitocôndrias, (3) estabelecimento da função do canal iônico usando eletrofisiologia e (4) validação in vitro de fármacos. Esses protocolos enfatizam estudos do receptor tipo A do ácido gama-aminobutírico (GABAA) 2,12,13,14,15,16, um canal de ânion cloreto e do principal receptor inibitório de neurotransmissores. No entanto, os métodos apresentados aqui se aplicam ao estudo de muitas outras células cancerosas e canais iônicos.

Protocol

1. Canais iônicos de imunomarcação em células cultivadas Preparação das células e montagem experimentalManter as células como cultura em crescimento ativo em frascos de cultura de 75cm2 . Passe as células uma vez até que elas se tornem 50%-90% confluentes, dependendo do tempo de duplicação da linhagem celular que está sendo usada.OBS: Para o presente estudo, foram utilizadas células D283, uma linhagem celular de meduloblastoma do Grupo 3. Coletar as células do fr…

Representative Results

Acima estão selecionados procedimentos que podem ser empregados para caracterizar canais iônicos em células cancerosas. O primeiro protocolo destaca a coloração de um canal iônico. Como detalhado, existem muitos desafios ao colorir um canal iônico ou, para esse assunto, qualquer proteína que esteja presente na membrana extracelular. A Figura 1 mostra a coloração para uma subunidade do receptor GABAA pentamérica. O segundo protocolo destaca os resultados dos testes do es…

Discussion

Alterações na função do canal iônico alteram as cascatas de sinalização intracelular, o que pode afetar o funcionamento geral de uma célula. Na última década, tornou-se cada vez mais claro que os canais iônicos são importantes para o crescimento de células cancerígenas e metástases. É importante ressaltar que muitos canais iônicos são alvos primários de terapêuticas aprovadas visando uma ampla gama de distúrbios24. Pesquisadores investigaram se os canais iônicos poderiam ser …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem o apoio da Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation à S.S. e do financiamento da Harold C. Schott Foundation da Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, à S.S.

Materials

ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS – Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

References

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
  25. Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
  26. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  27. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  28. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
  29. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  30. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  32. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  33. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  34. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  35. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

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Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

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