Summary

Detección de canales iónicos en células cancerosas

Published: June 16, 2023
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Summary

La focalización farmacológica de los canales iónicos es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos. Se proporcionan protocolos detallados para caracterizar la función de los canales iónicos en las células cancerosas y analizar los efectos de los moduladores de los canales iónicos en la viabilidad del cáncer.

Abstract

Los canales iónicos son fundamentales para el desarrollo celular y el mantenimiento de la homeostasis celular. La perturbación de la función de los canales iónicos contribuye al desarrollo de una amplia gama de trastornos o canalopatías. Las células cancerosas utilizan canales iónicos para impulsar su propio desarrollo, así como para mejorar como tumor y asimilarse en un microambiente que incluye varias células no cancerosas. Además, los aumentos en los niveles de factores de crecimiento y hormonas dentro del microambiente tumoral pueden resultar en una mayor expresión de canales iónicos, lo que contribuye a la proliferación y supervivencia de las células cancerosas. Por lo tanto, la focalización farmacológica de los canales iónicos es potencialmente un enfoque prometedor para el tratamiento de neoplasias malignas sólidas, incluidos los cánceres cerebrales primarios y metastásicos. En este trabajo se describen protocolos para caracterizar la función de los canales iónicos en células cancerosas y enfoques para analizar los moduladores de los canales iónicos para determinar su impacto en la viabilidad del cáncer. Estos incluyen la tinción de una célula para un canal iónico, la prueba del estado polarizado de las mitocondrias, el establecimiento de la función del canal iónico mediante electrofisiología y la realización de ensayos de viabilidad para evaluar la potencia del fármaco.

Introduction

Las proteínas transportadoras de membrana son fundamentales para la comunicación entre las células, así como para mantener la homeostasis celular. Entre las proteínas transportadoras de membrana, los canales iónicos sirven para impulsar el crecimiento y desarrollo de las células y para mantener el estado de las células en entornos desafiantes y cambiantes. También se ha descrito que los canales iónicos impulsan y apoyan el desarrollo de tumores sólidos, tanto sistémicamente como en el sistema nervioso central (SNC)1,2. Por ejemplo, los canales KCa3.1 son responsables de regular el potencial de membrana y controlar el volumen celular, lo cual es importante en la regulación del ciclo celular. Se ha descrito que los canales defectuosos de KCa3.1 contribuyen a la proliferación anormal de las células tumorales3. Además, los canales iónicos pueden contribuir a la diseminación metastásica de los cánceres. Los canales de potencial receptor transitorio (TRP), por ejemplo, están implicados en la entrada de Ca 2+ y Mg2+; Esta afluencia activa varias quinasas y proteínas de choque térmico que funcionan para regular la matriz extracelular que rodea a un tumor, lo que a su vez es importante para iniciar la metástasis del cáncer4.

Dado que los canales iónicos pueden contribuir al desarrollo de cánceres, también pueden ser objetivos para el tratamiento del cáncer relacionado con medicamentos. Por ejemplo, la resistencia a las modalidades de tratamiento, incluida la quimioterapia y la inmunoterapia novedosa, está relacionada con la desregulación de la función de los canales iónicos 5,6,7. Además, los canales iónicos están emergiendo como importantes dianas farmacológicas para impedir el crecimiento y el desarrollo de cánceres, con fármacos de moléculas pequeñas reutilizados (aprobados por la FDA) que se están examinando, así como biopolímeros, incluidos los anticuerpos monoclonales 1,2,8,9. Si bien ha habido muchos avances en este frente, el descubrimiento de fármacos contra el cáncer por canales iónicos sigue estando poco desarrollado. Esto se debe en parte a los desafíos únicos de estudiar los canales iónicos en las células cancerosas. Por ejemplo, existen limitaciones técnicas en la configuración de ensayos electrofisiológicos para compuestos de acción lenta y diferencias temporales en la activación del canal y la acción del fármaco. Además, la solubilidad de los compuestos también puede impedir el progreso, ya que la mayoría de los sistemas de electrofisiología automatizados que se utilizan habitualmente hoy en día utilizan sustratos hidrófobos, que pueden contribuir a la formación de artefactos como resultado de la adsorción de los compuestos. Además, las terapias moleculares bioorgánicas de gran tamaño, como los productos naturales, los péptidos y los anticuerpos monoclonales, son técnicamente difíciles de cribar mediante ensayos de electrofisiología convencionales10. Por último, las propiedades bioeléctricas de las células cancerosas siguen siendo poco conocidas11.

Mientras tanto, la tinción por inmunofluorescencia de los canales iónicos suele ser un reto. Esto se debe, en parte, a la complejidad de sus estructuras y su contexto en la membrana, que afectan a la capacidad de generar y emplear anticuerpos para estudios de microscopía. Es especialmente importante que los anticuerpos utilizados para teñir los canales iónicos sean validados en cuanto a especificidad, afinidad y reproducibilidad. Los anticuerpos comerciales para los canales iónicos deben considerarse en función de su estrategia de validación y su historial de publicación. Los experimentos deben incluir controles negativos para demostrar la falta de unión inespecífica por knockdown o knockout de la proteína diana. Alternativamente, las líneas celulares en las que la proteína diana está ausente o en baja abundancia en función de las determinaciones de ARNm o proteínas pueden servir como controles negativos. Por ejemplo, este estudio muestra la localización de la subunidad del receptor (GABA) Gabra5 en una línea celular de meduloblastoma (D283). Las células D283 con una eliminación de siRNA y las células Daoy, otra línea celular de meduloblastoma cerebeloso, se tiñeron para Gabra5 y no mostraron tinción apreciable (datos no mostrados).

Aquí, se presentan métodos para analizar y ensayar la función de los canales iónicos, así como el efecto de los moduladores de los canales iónicos en las células cancerosas. Se proporcionan protocolos para (1) teñir células para un canal iónico, (2) probar el estado polarizado de las mitocondrias, (3) establecer la función del canal iónico mediante electrofisiología y (4) validación in vitro del fármaco. Estos protocolos enfatizan los estudios del receptor 2,12,13,14,15,16 del ácido gamma-aminobutírico tipo A (GABAA), un canal de anión cloruro y un receptor de neurotransmisor inhibidor mayor. Sin embargo, los métodos presentados aquí se aplican al estudio de muchas otras células cancerosas y canales iónicos.

Protocol

1. Inmunomarcaje de canales iónicos en células cultivadas Preparación de las células y puesta en marcha experimentalMantener las células como un cultivo en crecimiento activo en matraces de75 cm2 de cultivo. Pase las células una vez hasta que se vuelvan 50%-90% confluentes, dependiendo del tiempo de duplicación de la línea celular que se esté utilizando.NOTA: Para el presente estudio, se utilizaron células D283, una línea celular de meduloblastoma del Grupo 3. Recoja…

Representative Results

Arriba se presentan procedimientos seleccionados que se pueden emplear para caracterizar los canales iónicos en las células cancerosas. El primer protocolo destaca la tinción de un canal iónico. Como se ha detallado, existen muchos retos a la hora de teñir un canal iónico o, para el caso, cualquier proteína que esté presente en la membrana extracelular. En la Figura 1 se muestra la tinción de una subunidad del receptor pentámero GABAA. El segundo protocolo destaca los re…

Discussion

Los cambios en la función de los canales iónicos alteran las cascadas de señalización intracelular, lo que puede afectar el funcionamiento general de una célula. Durante la última década, se ha vuelto cada vez más claro que los canales iónicos son importantes para el crecimiento y la metástasis de las células cancerosas. Es importante destacar que muchos canales iónicos son objetivos primarios para terapias aprobadas dirigidas a una amplia gama de trastornos24. Los investigadores han i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen el apoyo de la Fundación de la Familia Thomas E. y Pamela M. Mischell a S.S. y el financiamiento de la Fundación Harold C. Schott de la Cátedra Harold C. Schott de la Facultad de Medicina de la UC, a S.S.

Materials

ABS SpectraMax Plate Reader Molecular Devices ABS
Accutase Invitrogen 00-4555-56
Alexa Flor 488 Invitrogen A32723 Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062 100x
B27 Supplement Gibco 12587-010 Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet LABCONCO 302381101 Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1606-100
CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-211 Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride Fisher Scientific C7902 Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm Fisher Scientific 12-600-004 Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2 Fisher Scientific 430641U Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well Fisher Scientific 353046 Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well Fisher Scientific 353072 Cell culture treated
Centrifuge Eppendorf EP-5804R Refrigerated
Corning CoolCell Fisher Scientific 07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-553-450 Corning brand
D283 Med ATCC HTB-185
DABCO Mounting Media EMS 17989-97
D-Glucose Sigma Life Sciences D9434
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650 Cell culture grade
DMEM/F12, base media Fisher Scientific 11330-032 With phenol red
DMEM/F12, phenol red free Fisher Scientific 21041-025
EGTA Sigma Aldrich E4378
Epidermal Growth Factor STEMCELL 78006.1
FCCP Abcam AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic Millipore GF003
GARBA5 Antibody Aviva ARP30687_P050 Rabbit Polyclonal
Glutamax Gibco 35050-061
Glycerol Mounting Medium EMS 17989-60 With DAPI+DABCO
Hemocytometer Millipore Sigma
Heparin STEMCELL 7980
HEPES HyClone SH3023701 Solution
HEPES Fisher Scientific BP310-500 Solid
ImageJ Open platform With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI EMS 17989-97
KRM-II-08 experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor Novus N276314100U
L-Glutamine Gibco 25030-081
Magnesium Chloride Sigma Aldrich M9272 Hexahydrate
Microscope, Confocal Leica SP8
Microscope, Light VWR 76382-982 DMiL Inverted
MTS – Promega One Step Promega G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL Eppendorf Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL Eppendorf Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL Eppendorf Z683957
Nest-O-Patch Heka
Neurobasal-A Medium Gibco 10888022 Without vitamin A
Neurobasal-A Medium Gibco 12348-017 Phenol red free
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050
NOR-QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm Fisher Scientific 50-998-944 4 inch width
Paraformaldehyde EMS RT-15710
PATHCHMASTER Heka
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Perfusion System Nanion 4000120
PFA EMS RT-15710
Phosphate Bufered Saline Fisher Scientific AAJ75889K2 Reagent grade
Poly-D-Lysine Fisher Scientific A3890401
Poly-L-Lysine Sigma Life Sciences P4707
Port-a-Patch Nanion 21000072
Potassium Chloride Sigma Life Sciences P5405
Primary Antibody Invitrogen MA5-34653 Rabbit Monoclonal
Prism GraphPad
Propofol Fisher Scientific NC0758676 1 mL ampule
QH-II-66 experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs VWR 89094-664 Sterile
Slides, 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-544-7 Frosted one side
Sodium Bicarbonate Corning 25-035-Cl
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070
Synth-a-Freeze Medium Gibco R00550 Cryopreservation
TMRE Fisher Scientific 50-196-4741 Reagent
TMRE Kit Abcam AB113852 Kit
Triton X-100 Sigma Aldrich NC0704309
Trypan Blue Gibco 15-250-061 Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA Gibco 25200-072 Solution, 0.25%
Vortex Mixer VWR 97043-562
Whatman Filter Paper Fisher Scientific 09-927-841

References

  1. Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies. Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).
  2. Rao, R., et al. Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers. Frontiers in Physiology. 13, 839437 (2022).
  3. Mohr, C. J., et al. Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1. Cancers. 11 (1), 109 (2019).
  4. Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. The role of TRP channels in the metastatic cascade. Pharmaceuticals. 11 (2), 48 (2018).
  5. Eil, R., et al. Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function. Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).
  6. Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen’kyi, V. Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential. Frontiers in Pharmacology. 10, 606 (2019).
  7. Kischel, P., et al. Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance. Cancers. 11 (3), 376 (2019).
  8. Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer. Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).
  9. Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs. Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).
  10. Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. Ion channel drug discovery: Challenges and future directions. Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).
  11. Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review. Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).
  12. Sengupta, S., et al. α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth. Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).
  13. Jonas, O., et al. First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development. Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).
  14. Kallay, L., et al. Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death. Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).
  15. Pomeranz Krummel, D. A., et al. Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).
  16. Bhattacharya, D., et al. Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer. Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).
  17. Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy. Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).
  18. Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions. Cells. 9 (4), 958 (2020).
  19. Baker, J. R. Fixation in cytochemistry and electron-microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).
  20. Chung, J. Y., et al. Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).
  21. Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).
  22. Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture. Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).
  23. Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules. EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).
  24. Zheng, J., et al. Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV. Journal of Oncology. 2019, 7362875 (2019).
  25. Konno, K., Watanabe, M., Luján, R., Ciruela, F. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. Receptor and Ion Channel Detection in the Brain. , (2016).
  26. Mortensen, M., Smart, T. G. Single-channel recording of ligand-gated ion channels. Nature Protocols. 2 (11), 2826-2841 (2007).
  27. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  28. Rafehi, H., et al. Clonogenic assay: Adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (49), 2573 (2011).
  29. Scudiero, D. A., et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).
  30. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, e10202 (2010).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S. Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).
  32. Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).
  33. Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C. Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).
  34. Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).
  35. Sun, J., et al. STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion. Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).

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Kallay, L., Gawali, V. S., Toukam, D. K., Bhattacharya, D., Jenkins, A., Sengupta, S., Pomeranz Krummel, D. A. Screening Ion Channels in Cancer Cells. J. Vis. Exp. (196), e65427, doi:10.3791/65427 (2023).

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